綜合分析了影響茉莉花原生質體分離的主要因素,建立了茉莉花花瓣原生質體的瞬時轉化體係。試驗流程為：以溫室或自然環境中生長並盛開的花原茉莉花朵為材料,取其充分展開的花瓣為外植體(圖6-A),用刀片將花瓣切割到足夠纖細且均勻,移至含15G·1-1纖維素酶,4G·1-1離析酶和8G·1-1果膠酶的酶解混合液中,每5m1酶解液可酶解約0.5G花瓣量(圖6-B),酶解5h,過濾收集到的原生質體經過清洗和沉澱,可獲得明顯的原生質體聚集層(圖6-C)。用mmG溶液將收集到的生质时表原生質體稀釋至濃度為4×105個·m1-1,按75μG·m1-1原生質體的比例加入含GFP標簽的外源質粒dnA,再加入等體積的400G·1-1PEG溶液,混勻後,室溫誘導約5min,轉化後的原生質體暗處孵育16h後,在熒光顯微鏡下可觀察到發出綠色熒光信號的原生質體(圖6－E),說明含GFP熒光蛋白標簽的質粒可高通量導入茉莉花花瓣原生質體,並得到穩定表達。
進一步利用含有轉錄因子Js1hY-GFP融合載體,体瞬進行目標基因的原生質體表達研究。以P35s-GFP空載體為對照,达体分別轉入茉莉花瓣原生質體後,通過激光共聚焦顯微鏡掃描檢測它們的亞細胞定位。觀察顯示GFP表達載體轉入花瓣原生質體後,建立及其細胞核、細胞質和細胞膜等部位均有明顯綠色熒光信號,茉莉這與其他植物原生質體轉化中觀察到的結果一致,而轉入Js1hY-GFP融合載體的花瓣原生質體產生的綠色熒光信號主要集中在細胞核中(圖7),說明轉錄因子Js1hY定位於茉莉花細胞的細胞核中行使功能。
為檢驗茉莉花來源的蛋白在茉莉花原生質體和異源表達體係中的亞細胞定位是否一致,本研究選擇了茉莉花的2個糖轉運蛋白家族成員JssWEET1和JssWEET17,采用上述優化建立的茉莉花花瓣原生質體瞬時轉化係統來分析它們的亞細胞分布,同時以擬南芥葉片原生質體係統作為對照。由於白色花瓣原生質體中不含葉綠體,生质时表無法檢測到葉綠體產生的自發熒光,激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示,JssWEET1-GFP融合蛋白分布於茉莉花瓣原生質體細胞膜上,同時在胞質中有明顯的斑點狀分布,而在擬南芥葉肉原生質體中JssWEET1-GFP主要以斑點狀分布於細胞質中(圖8-A和C)。JssWEET17-GFP在茉莉花瓣原生質體和擬南芥葉片原生質體中均主要分布於細胞質或胞質內膜係統中(圖8－B和d)。体瞬
茉莉花作為一種有重要經濟價值的达体花卉植物,由於其轉基因技術的缺少使得其在遺傳轉化等方麵的研究極其困難,而使用原生質體進行瞬時轉化則在一定程度上克服了這一障礙。目前,建立及關於茉莉花原生質體製備方法的研究尚未見報道。因此,茉莉本研究在借鑒擬南芥原生質體製備的基礎上,探索了茉莉花植株上適合分離出原生質體的組織器官,係統地改良了其原生質體的製備條件和轉化條件,獲得了擁有較高數量和活力的花瓣原生質體,並表現出較好的轉化效果。茉莉花花瓣原生質體轉化體係的花原建立,為茉莉花基因和蛋白的研究提供了快捷且更有針對性的受體材料和實驗平台,避免了利用其他模式植物瞬時轉化體係可能帶來的表達或定位紊亂,使得研究結果更具說服力。
獲得高質量的生质时表植物原生質體,需要考慮到合適的外植體、酶液組合與濃度、酶解時間和酶液滲透壓等關鍵因素,幼嫩外植體常是分離原生質體的最佳材料,研究表明,盛開的茉莉花花瓣相較於葉片具備組織幼嫩、細胞排列鬆散等特點,更適合作為原生質體遊離的材料。本研究還發現果膠酶對茉莉花花瓣原生質體的分離有關鍵作用,當酶液中缺少果膠酶時遊離出的原生質體數量稀少,而在纖維素酶、離析酶和果膠酶同時使用時,原生質體產量有明顯改善。經綜合分析,本試驗中分離茉莉花瓣原生質體的最適宜酶類組合為：15G·1-1纖維素酶＋4G·1-1離析酶＋8G·1-1果膠酶,最優酶解時間為5h。
由於可以清晰看見其細胞膜與細胞器,使原生質體在蛋白亞細胞定位上更具有優勢,利用原生質體進行簡易的基因瞬時表達及亞細胞定位是當前研究植物分子與細胞生物學中最常用且高效的方法。本實驗室在研究茉莉花開花過程相關功能基因時,鑒定到一係列在茉莉花瓣中特異性高度表達的基因,采用已建立的茉莉花瓣原生質體表達係統,成功鑒定了擬南芥生物鍾調控轉錄因子AT1hY在茉莉花中的同源蛋白Js1hY具有細胞核定位特性。此外,茉莉花的糖轉運蛋白家族可能介導跨細胞膜的糖運輸與儲存,其家族多個成員在開花過程中表達量顯著上調,煙草葉片瞬時表達顯示它們多分布於細胞膜或胞質內膜中,研究也表明,JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP分別定位於茉莉花瓣原生質體的細胞膜和細胞質中,同時JssWEET1-GFP還以斑點狀分布於細胞質中,猜測其可能通過高爾基體或囊泡等細胞器參與糖分運輸,這些結果意味著它們介導的生物學功能發生在不同的細胞器中。在擬南芥葉片原生質體中,JssWEET17-GFP的分布與其在茉莉花瓣原生質體中的定位基本一致,而JssWEET1-GFP在細胞膜上定位信號較弱,主要以斑點狀分布於胞質中,說明其亞細胞分布可能具有組織細胞特異性。
相較於成熟的擬南芥葉肉原生質體瞬時表達體係,本研究中茉莉花瓣原生質體的活性和轉化率還有待提升,不過由於栽培容易、自然盛開的茉莉花瓣容易收集、酶解時間短等優點,使得花瓣原生質體的分離和轉化試驗可在1d內完成,有效促進了某些基因功能的研究分析。受限於組織特異性,花瓣原生質體中不含葉綠體,所以研究與葉綠體相關的蛋白或基因可能需要共轉化對照質粒,未來對茉莉花葉片的原生質體分離體係仍需進一步優化。
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