目的血清学探心氏心病探討養心氏片治療冠心病的藥效物質基礎與潛在的作用機製。方法采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術對養心氏片(Yangxinshitablet，药物药理用机YXST)的化学入血成分進行分析；利用STITCH、TCMSP、结合BindingDB數據庫預測YXST入血成分的网络靶點；采用TTD、DrugBank、讨养PharmGKB、片治MalaCards、疗冠CTD數據庫收集冠心病相關靶點；通過STRING數據庫對得到的质基制成分靶點和疾病靶點構建蛋白相互作用關係(protein-proteininteraction，PPI)網絡從而篩選YXST治療冠心病的础作潛在靶點；利用R軟件的clusterProfiler包對潛在靶點進行基因本體論(geneontology，GO)功能注釋和京都基因和基因組百科全書(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，血清学探心氏心病KEGG)通路分析；采用Cytoscape軟件構建“入血成分-潛在靶點”網絡並分析關鍵化合物和關鍵靶點。药物药理用机
結果通過對大鼠口服灌胃給予YXST提取液後的化学血漿進行分析，共檢測到26個原型成分。结合在數據庫中收集得到入血成分對應的网络287個靶點和冠心病相關的199個靶點。通過交集分析和PPI網絡的構建共獲得70個YXST治療冠心病的潛在靶點。對潛在靶點進行GO功能注釋和KEGG通路分析發現，YXST治療冠心病主要涉及了炎症反應、氧化應激以及晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體(advancedglycationendproducts-receptorforadvancedglycationendproducts，AGE-RAGE)、動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子(tumournecrosisfactor，TNF)、白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、C型凝集素受體、Th17細胞分化、Toll樣受體等信號通路。通過構建“入血成分-潛在靶點”網絡分析得到3個關鍵化合物和16個關鍵靶點。結論YXST可通過調節TNF、PTGS2、NOS2、NOS3等關鍵靶點幹預炎症反應、氧化應激、動脈粥樣硬化等過程發揮治療冠心病的作用，其潛在的有效成分為大豆苷、小檗堿和葛根素。本研究充分體現了YXST通過多成分-多靶點-多途徑治療冠心病的作用特點，為深入研究YXST的藥理作用機製提供重要參考。
冠心病是臨床上常見的一種心血管疾病，主要發生於中老年人群。近年來，隨著人們飲食結構和生活習慣的變化，該病的發病率和死亡率逐年上升，並呈現年輕化趨勢，嚴重威脅人類健康。冠心病主要是由冠狀動脈結構或功能異常，使血管狹窄、痙攣或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心髒疾病。中醫理論認為，冠心病屬“胸痹”“心痛”範疇，因痰濁阻滯，瘀血氣滯，累及於心，導致心脈不暢，血脈痹阻，故治療原則上應以活血化瘀為法。
養心氏片(Yangxinshitablet，YXST)是由黃芪、黨參、丹參、葛根、淫羊藿、山楂、地黃、當歸、黃連、延胡索、靈芝、人參和甘草共13味藥材製成的一種中藥複方製劑，具有益氣活血、化瘀止痛之功效，在臨床上常用於治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等心血管疾病。現代藥理學研究表明，YXST具有抗血小板聚集、降低血黏度、抑製血栓形成、降低心肌耗氧量、改善心肌缺血，增強心功能等作用。目前，對YXST的研究多集中於臨床或是在動物模型上對某些因子的考察，缺乏對其藥效物質基礎和作用機製的深入研究。
網絡藥理學融合了係統生物學、多向藥理學等理論，通過對“藥物-靶點-疾病”之間複雜互作關係網絡的分析，多層次地闡明藥物治療疾病的作用機理。網絡藥理學具有整體、係統的分析特點，已經被廣泛應用於中藥領域各方麵的研究。此外，血清藥物化學認為，給藥後血液中含有的成分才是中藥複方在體內直接發揮藥效作用的物質。因此，本研究首先采用HPLC-ESIQ-TOF-MS/MS技術對YXST的入血成分進行分析。在此基礎上，結合網絡藥理學技術分析YXST入血成分的作用靶點，探討YXST治療冠心病可能的物質基礎和作用機製。
1材料與方法
1.1儀器與試劑
超高效液相色譜儀，配置在線脫氣機、四元泵、柱溫箱、自動進樣器和紫外檢測器均購自美國Waters科技有限公司；TripleTOF5600plus質譜儀(美國ABSCIEX公司)；XS105DU十萬分之一電子天平(瑞士MettlerToledo公司)；Milli-Q超純水係統(美國Millipore公司)；H1650-W型高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
YXST(規格：0.6g×36片/盒；批號：151102)由青島國風藥業股份有限公司提供。木蘭花堿(批號：MUST-15110910)、葛根素(批號：MUST-13111203)、甘草苷(批號：MUST-16032801)、黃連堿(批號：MUST-15011004)、表小檗堿(批號：MUST-15022101)、大豆苷(批號：MUST-12102710)、非洲防己堿(批號：MUST-13101201)、鹽酸藥根堿(批號：MUST-15112011)、鹽酸小檗堿(批號：MUST-12122110)、巴馬汀(批號：MUST-12022707)、脫氫紫堇堿(批號：MUST-12051002)、丹酚酸B(批號：MUST-13103113)和靈芝酸A(批號：MUST-16051010)對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均>98%。甲醇(色譜純，批號：20141016)購自百靈威科技有限公司；甲酸(色譜純，批號：k1612047)購自阿拉丁試劑有限公司；其餘試劑均為分析純。
1.2動物
6隻SD大鼠，♂，體質量(200±20)g，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心。動物使用許可證號：SYXK(浙)2012-0178。適應性飼養1周，自由進食飲水，保持12h光照/黑暗，溫度為(20±2)℃，相對濕度控製在(50±10)%。所有動物實驗操作遵守浙江大學實驗動物道德倫理委員會有關規定。
1.3樣品製備
1.3.1YXST提取液的製備
取YXST，除去包衣，研細。稱取20g粉末，用500mL70%甲醇超聲處理60min，抽濾，將提取液濃縮至每1mL含生藥粉末1g。
1.3.2大鼠血漿樣品的製備
大鼠受試前12h禁食不禁水，口服灌胃給予YXST提取液14g·kg–1。給藥前和給藥後1h從尾靜脈取血0.5mL，4000r.min-1離心5min，分離血漿，於–20℃下保存。分析前，取血漿樣品200μL，加入5倍量甲醇，渦旋30s後靜置10min，13000r.min-1離心10min。取上清液在常溫下氮氣吹幹，殘渣用200μL70%甲醇複溶，13000r.min-1離心10min，取上清供HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析。
1.4色譜與質譜條件
HPLC分離采用WatersUPLCsystem，色譜柱為WatersCORTECSC18+(4.6mm×150mm,2.7μm)。流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B)，梯度洗脫：0~20min，5%→25%B；20~40min，25%→41%B；40~60min，41%→81%B；60~65min，81%→96%B；65~70min，96%B。分析時間70min，後運行10min，進樣量10μL，流速0.5mL·min–1，柱溫35℃。
質譜分析采用TripleTOF5600plus質譜儀，對ESI正(+)負(–)離子同時進行掃描，參數設置如下：噴霧電壓：+5.5kV(+)和−4.5kV(–)；離子源溫度：600℃(+)和550℃(–)；Gas1：空氣，50psi；Gas2：空氣，50psi；CUR：氮氣，30psi；碰撞電壓：(40±20)V；掃描範圍：TOF-MS為m/z100~2000，TOF-MS/MS為m/z50~2000。實驗數據利用Peakview軟件(ABSCIEX,version1.2.0.3)進行處理。
1.5網絡藥理學分析
1.5.1YXST入血成分靶點的收集
基於上述鑒別得到的YXST入血成分，用化合物名稱或結構式(SMILES格式表示)為；
關鍵詞在STITCH(SearchToolforInteractionsofChemicalsandProteinsDatabase,http://stitch.embl.de/)；
TCMSP(TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；
BindingDB(https://www.bindingdb.org/bind/index.jsp)；
數據庫中進行檢索，得到每個入血成分的靶點。
再通過UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)將靶點名歸整成標準基因名(Officialsymbol)，限定物種為“Homosapiens”。
1.5.2冠心病相關靶點的收集
以“coronaryheartdisease”“coronarydisease”為關鍵詞：
通過TTD(TherapeuticTargetDatabase,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；
DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)；
MalaCards(https://www.malacards.org/)；
CTD(ComparativeToxicogenomicsDatabase,http://ctdbase.org/)
數據庫進行檢索，獲取冠心病相關的靶點，並按“1.5.1”項下方法進行標準化。
1.5.3YXST治療冠心病潛在靶點的篩選
取入血成分靶點與疾病靶點的交集，即得YXST治療冠心病的直接作用靶點。此外，將成分靶點和疾病靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/)進行蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI)分析，限定物種為“Homosapiens”，根據置信度分值選擇confidencescore≥0.7的數據，並使用Cytoscape軟件(version3.6.0)進行可視化，進一步篩選與疾病靶點存在間接作用關係的成分靶點。將直接和間接作用靶點合並即得YXST治療冠心病的潛在靶點。
1.5.4功能注釋及通路分析
基於上述所得的YXST治療冠心病的潛在靶點，利用R語言(version3.4.1)的clusterProfiler包進行基因本體論(geneontology，GO)功能注釋和京都基因和基因組百科全書(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)通路分析，探索YXST治療冠心病的分子作用機製。
1.5.5網絡的構建及分析
將得到的入血成分和對應的潛在靶點導入Cytoscape軟件構建“入血成分-潛在靶點”網絡圖，再利用NetworkAnalyzer插件對網絡進行拓撲性質分析，包括節點度(degree)、介數中心度(betweennesscentrality)和緊密中心度(closenesscentrality)。依據3項數值均在平均值以上的標準篩選YXST治療冠心病的關鍵化合物和關鍵靶點。
聲明：本文所用圖片、文字來源《中國現代應用藥學》2020年8月，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
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