阿爾泰金蓮花（Trolliusaltaicus），酶辅為毛茛科金蓮花屬多年生草本植物，助超主要生長於我國新疆阿勒泰、声提塔城地區，尔泰性苦寒，金莲具有清熱解毒、花总黄酮消炎殺菌、工艺止血止咳等功效，研究其幹燥花蕾臨床上多用於呼吸道感染、酶辅急慢性咽炎和扁桃體炎等病症的助超治療，當地民間也將其泡水飲用以預防感冒等疾病。声提然而，尔泰作為商品金蓮花的金莲來源藥材之一，該藥材的花总黄酮研究報道較少。葒草素半乳糖苷等黃酮碳苷類化合物是工艺該藥材發揮藥效的主要活性成分，並進一步探討了其總黃酮的回流提取工藝。超聲輔助提取是利用超聲波的強烈的振動、空化、攪拌等效應破壞植物細胞壁，促進有效成分溶於提取溶劑中。酶輔助超聲提取法結合了酶法和超聲提取法的優點，不僅提取時間短、提取效率高，且能較好地保持提取物的特性和品質，現已被廣泛應用於中草藥活性成分的提取之中。本文擬通過考察酶製劑的種類、酶添加量、pH、料液比、提取時間、提取溫度以及提取功率對其所含黃酮提取率的影響，進一步結合Box-Behnken實驗設計和響應麵分析，優化阿爾泰金蓮花總黃酮的最佳酶輔助超聲提取工藝，為阿爾泰金蓮花及其總黃酮的深度開發提供參考數據。
一、材料與方法
1、材料與試劑
阿爾泰金蓮花藥材於2016年8月采集於新疆阿勒泰地區，經新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為阿爾泰金蓮花T.altaicus的幹燥花蕾，藥材粉碎，過40目篩。葒草素2-O-β-L-半乳糖苷對照品（OGA，上海源葉生物科技有限公司，質量分數98.0%，P31O7F23952）；纖維素酶:（4x105U/g）、半纖維素酶（1x105U/g）果膠酶（3x105U/g）和中性蛋白酶（5x105U/g）分別購自上海如吉生物科技發展有限公司；其他試劑均為國產分析純。
2、儀器與設備
AS係列超聲波清洗機：天津歐特賽恩斯儀器有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司；AL204型分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司，751型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司。
3、實驗方法
（1）對照品溶液的配製及標準曲線繪製
精密稱取幹燥至恒重的OGA對照品5.0mg於25mL容量瓶中，用70%乙醇溶解、稀釋至刻度，搖勻、靜置，得0.20mg/mL的0GA對照品溶液，保存備用。分別精密吸取對照品溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL分別置於25mL容量瓶中，各加水至8.0mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，混勻，放置6min後，加10%硝酸鋁溶液1.0mL，混勻放置6min後；再加4%氫氧化鈉試液10.0mL，加水至刻度，搖勻放置15min，以相應試劑為空白，在500nm處測定吸光度（A），以A為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標繪製標準曲線，得回歸方程Y=0.523X-0.0109，R2=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL範圍內有良好的線性關係關係。
（2）樣品溶液製備及其總黃酮測定
稱取一定量阿爾泰金蓮花，再分別向其中添加不同體積不同濃度的乙醇，加入酶，在一定溫度下分別超聲處理一定時間，製得供試樣品溶液。精密稱取幹燥至恒重的OGA對照品5.0mg於25mL容量瓶中，用70%乙醇溶解、稀釋至刻度，搖勻、靜置，得0.20mg/mL的0GA對照品溶液，保存備用。分別精密吸取對照品溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL分別置於25mL容量瓶中，各加水至8.0mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，混勻，放置6min後，加10%硝酸鋁溶液1.0mL，混勻放置6min後；再加4%氫氧化鈉試液10.0mL，加水至刻度，搖勻放置15min，以相應試劑為空白，在500nm處測定吸光度（A），以A為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標繪製標準曲線，得回歸方程Y=0.523X-0.0109，R2=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL範圍內有良好的線性關係關係。並計算提取率。阿爾泰金蓮花總黃酮提取率Y（%）=（C×V/M）x100%，式中：C為提取液中黃酮濃度（mg/mL），V為提取液體積（mL），M為藥材質量（mg）。
（3）酶製劑的選擇
稱取1.0g阿爾泰金蓮花若幹份，分別向其中加入占藥材質量1.0%的纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、中性蛋白酶，將一份未加任何酶製劑的樣品作對照組。每份樣品分別加50倍量50%乙醇，加入鹽酸緩衝液，調pH分別設定3、4、5、6，將上述各組樣品於40℃，超聲功率90W下超聲提取30min酶解後，各組樣品經滅酶（沸水浴5min），過濾得到上清液。分別從各組中取適量提取液，計算金蓮花總黃酮提取率。
（4）單因素試驗
稱取藥材1.0g，分別對超聲酶輔助提取工藝中的影響因素（酶添加量、料液比、提取溫度、提取時間、超聲功率）進行考察。酶添加量:0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；料液比：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50；乙醇濃度：30%、40%、50%、60%、70%；提取溫度：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃；提取時間：10min、20min、30min、40min、50min；超聲功率：90W、132W、174W、216W、258W、300W。
（5）響應麵試驗設計
根據Box-Behnken中心組合原理，在單因素試驗結果的基礎上，選擇酶添加量、乙醇濃度、提取時間和提取溫度四個因素為自變量，每一自變量的試驗分別以-1、0、1編碼，以總黃酮提取率（%）為響應值，進行四因素三水平實驗，利用Design-Expert8.05軟件對試驗多元線性回歸和二項式擬合，並對擬合方程進行方差分析。因素水平設計見表1。
二、結果與分析
1、酶製劑的篩選
不同酶製劑在不同pH條件下，所得總黃酮提取率也不相同。隨著pH的增加，在各種酶製劑作用下，阿爾泰金蓮花總黃酮提取率均呈現先增加後降低的趨勢。從圖1可以看出，纖維酶在pH等於4時作用最好，其提取率可以達到17.09%，大於中性蛋白酶、半纖維素酶、果膠酶、無酶作用下的提取率。原液的pH為6.5，因此從提取率考慮，改變溶液的pH為4，且選擇纖維素酶進行下一步試驗。
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