1.3.4 卵白蛋白消化產物對H₂O₂誘導的卵白Caco-2細胞內ROS的清除作用

細胞內ROS含量的測定采用文獻中報道的DCFH-DA熒光探針法，並稍作修改。蛋白道消細胞孵育以及試驗設置同1.3.3.3節，体外經過最後一步H₂O₂孵育6h後，模拟將96孔板中上清液吸棄，胃肠物用PBS清洗細胞後，化产化活每孔加入20μLDCFH-DA溶液，抗氧放入37℃、性及5%CO₂培養箱中孵育20min後，其结用PBS清洗細胞3次後加入DMEM，构表用酶標儀測定其在激發波長485nm、卵白發射波長525nm下的蛋白道消熒光強度。

1.3.5 體外模擬胃腸道消化產物（＜1ku）肽序列鑒定

1.3.5.1 肽序列鑒定

利用高效液相色譜-串聯質譜對體外模擬胃腸道消化產物（＜1ku）進行肽序列鑒定。体外色譜條件：流動相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）；流速：300nL/min；洗脫程序：5%～35%B（60min），模拟35%～75%B（4min），胃肠物75%B（10min）。

1.3.5.2 肽的合成

通過高效液相色譜-串聯質譜鑒定的肽，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，純度達到98%以上。

1.3.6 合成肽的體外抗氧化活性

1.3.6.1 合成肽的ABTS⁺·清除能力測定

方法同1.3.2.1節。

1.3.6.2 合成肽的ORAC測定

方法同1.3.2.2節。

1.4 數據統計分析

試驗結果用平均值±標準差表示，重複3次。用SPSS18.0軟件對數據進行顯著性分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 卵白蛋白及其消化產物的體外抗氧化活性

2.1.1 ABTS⁺·清除能力測定

蛋白以及蛋白產物的ABTS自由基清除活性結果如圖1所示。可以看出，卵白蛋白及其消化產物對ABTS自由基的清除能力均具有濃度依賴性，大小順序依次為：體外模擬胃腸道消化產物＜1ku、體外模擬胃腸道消化產物1～3ku、體外模擬胃腸道消化產物3～10ku、卵白蛋白，說明卵白蛋白經過體外模擬胃腸道消化後，其消化產物的ABTS自由基清除活性均有不同程度的增強，這一結論與文獻中已有的報道相符，說明蛋白經過體外模擬胃腸道消化後，產生了新的具有抗氧化活性的肽段或氨基酸。可以發現，分子質量越小的組分表現出越強的ABTS自由基清除活性，其中，分子質量＜0.05），最高濃度清除率達49.48%，Foh等以羅非魚為原料，得到蛋白水解物，同樣發現了分子質量＜1ku的組分ABTS自由基清除能力最強，與其它組分存在顯著性差異（P＜0.05），最高濃度清除率達49.48%，Foh等以羅非魚為原料，得到蛋白水解物，同樣發現了分子質量＜1ku的組分清除ABTS自由基的能力最強，高於分子質量＜3ku的組分和分子質量＜5ku的組分。

2.1.2 ORAC測定

蛋白以及蛋白產物的氧自由基吸收能力結果如圖2所示。ORAC值最大的組分仍然為體外模擬胃腸道消化產物（5ku的組分仍然為體外模擬胃腸道消化產物（＜1ku），依次為體外模擬胃腸道消化產物（1～3ku）、體外模擬胃腸道消化產物（5～10ku）、卵白蛋白。其中體外模擬胃腸道消化產物（＜1ku）和體外模擬胃腸道消化產物（1～3ku）的ORAC值分別為1.21μg/mLTE/μg/mL和2.07μg/mLTE/μg/mL，高於Trolox的ORAC值（1μg/mLTE/μg/mL）。這一結果與上述結果一致，說明經過體外模擬胃腸道消化，卵白蛋白被酶解，釋放出新的抗氧化肽段，抗氧化肽段表現出更強的氧自由基吸收能力，並且分子質量越小的肽段，ORAC值越大。這一結果與文獻中已有的報道相符：Vilcacundo等以藜麥蛋白為原料，經過體外模擬胃腸道消化後，分子質量＜5ku的組分ORAC值高於分子質量＞5ku的組分。

2.2 卵白蛋白及其消化產物的細胞抗氧化活性

2.2.1 H₂O₂誘導的Caco-2細胞氧化損傷模型的建立

不同濃度的H₂O₂對Caco-2細胞存活率的影響如圖3所示。H₂O₂容易通過細胞膜，在細胞內產生高活性自由基，從而引發機體氧化應激，最終導致細胞損傷或凋亡。當H₂O₂濃度由400μmol/L增加到900μmol/L時，細胞存活率逐漸降低，與未經H₂O₂處理組（對照組）存在顯著性差異，當H₂O₂濃度在700μmol/L時，細胞存活率為48%，約為對照組細胞存活率的50%，當H₂O₂濃度在900μmol/L時，細胞存活率為13%，細胞氧化損傷過於嚴重，此時蛋白及其產物難以表現出對細胞的保護作用，綜合以上因素，選用700μmol/L的H₂O₂構建細胞氧化損傷模型，探究體外模擬胃腸道消化的卵白蛋白產物的細胞抗氧化活性。

2.2.2 卵白蛋白消化產物對Caco-2細胞氧化損傷的保護作用

卵白蛋白體外模擬胃腸道消化產物對H₂O₂誘導的細胞氧化應激損傷的保護作用結果如圖4所示。按照2.2.1節構建得到的細胞氧化損傷模型，H₂O₂處理組（損傷組）細胞存活率約為對照組的50%，與對照組存在顯著性差異（P＜0.05）。在H₂O₂處理細胞之前，用不同質量濃度的肽（0.01，0.1，1mg/mL）處理細胞，體外模擬胃腸道消化產物（3～10ku）和體外模擬胃腸道消化產物（1～3ku）細胞存活率與損傷組細胞沒有顯著性差異（P＞0.05），對細胞沒有氧化損傷的預先保護作用。當體外模擬胃腸道消化產物（＜1ku）質量濃度為0.01mg/mL時，細胞存活率與損傷組細胞沒有顯著性差異（p＞0.05），隨著產物濃度的升高，細胞存活率逐漸提高，與損傷組存在顯著性差異（P＜0.05），表明體外模擬胃腸道消化產物（＜1ku）對H₂O₂誘導的細胞氧化應激損傷具有保護作用。值得注意的是：由於模型中所采用的細胞為人結腸癌細胞係（Caco-2細胞），Caco-2細胞經分化後類似小腸細胞並可表達成熟的小腸細胞的特征，進而該細胞被廣泛用於吸收模型研究。推測卵白蛋白經過體外模擬胃腸道消化後，被Caco-2細胞吸收，在細胞內發揮保護作用，從而提高細胞存活率。並且，在未經H₂O₂處理、消化質量濃度為1mg/mL時，細胞存活率與對照組相比表現為既不升高也不降低，與對照組無顯著性差異（P＞0.05），表明消化產物對Caco-2細胞既沒有毒性作用，也不促進細胞增殖。

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