大量的醇脱催化天然和非天然生物活性物質分子中具有一個或多個呱啶環，包括許多市售的氢酶活性藥物成分。手性呱啶醇及其衍生物是合成製藥工業中重要的中間體，比如(S)-N-Boc-3-羥基呱啶(S)-NBHP)是醇脱催化合成依魯替尼藥物的關鍵手性中間體，其市售品名為Imbmvica，氢酶是合成一種靶向B細胞的抗癌藥物。依魯替尼已於2013年獲得美國食品和藥物管理局的醇脱催化批準用於治療套細胞淋巴瘤，分別於2014年和2015年獲得批準用於治療慢性淋巴細胞性白血病和淋巴漿細胞性淋巴瘤。氢酶目前手性呱啶醇主要是合成通過化學方法將原料通過多步轉化製備而得.產率和產品純度不理想同。最近，醇脱催化酮還原酶(KRED)催化N-Boc-3-呱啶酮(NBPO)的氢酶不對稱還原反應在手性呱啶醇的合成中顯示出良好的性能。2014年通過商業KRED實現100g/LNBPO的合成生物轉化，首開醇脫氫酶合成(S)-NBHP的醇脱催化先河。然而，氢酶本篇研究中所采用的合成KRED及其後報道的醇脫氫酶均具有一定程度的底物抑製和產物抑製，且反應需要添加昂貴的輔酶，不利於高濃度條件下實現酶法規模化製備(S)-NBHP。因此，篩選具有良好催化性能的醇脫氫酶(或酮還原酶)對實現高效酶法製備(S)-NBHP具有重要意義。
作者對本實驗室保存的還原酶庫進行了篩選,旨在獲得對NBP0具有優良催化性能的還原酶。該酶庫中的還原酶具有20％～50％的氨基酸序列同源性，並能夠催化還原多種酮類物質。研究發現，來源Kluyveromycespolyspora的醇脫氫酶KpADH顯示出較大的潛力，適用於酶法不對稱合成(S)-NBHP。基於對不同反應體係的研究，解釋了產物抑製的主要因素，並通過不添加任何助溶劑的單水相體係解除了產物抑製的影響，實現了無需額外添加輔酶NADPH的條件下(S)-NBHP的高效和綠色合成。
輔酶NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、NADP+(氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、NADH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NAD+(氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)等：購於深圳邦泰生物科技有限公司；質粒DNA抽提試劑盒、PCR產物回收試劑盒、β-巰基乙醇、TEMED、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那黴素(Kan)等：購於上海捷瑞生物工程有限公司：N-Boc-3-羥基呱啶：購於上海麥克林生物公司：N-Boc-3-呱啶酮：購於上海皓伯化工有限公司。
所有質粒均保存於江南大學生物工程學院生物催化與酶工程實驗室還原酶文庫，並在Escherichia.coliBL21(DE3)中表達。
以NBP0作為底物，在30℃下測定340nm處NAD(P)H吸光度的變化，計算比活力。200μL活力測定體係包括：10μL粗酶液(適當稀釋倍數)，10μLNBPO(溶於乙醇，終濃度為5mmol/L)，10μLNAD(P)H(終濃度為1mmol/L)和170μL磷酸緩衝液(100mmol/L，pH7.0)。一個酶活力單位(U)定義為在上述條件下每分鍾氧化1μmolNAD(P)H所需的酶量。
反應液用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉幹燥，並通過真空蒸發器揮發乙酸乙酯。采用高效液相色譜法(HPLC)分析立體選擇性及轉化率。立體選擇性分析采用SuperchiralS-AY柱(4.6mm×150mm，ShanghiraiChiralwayBiotechCo.Ltd)測定，流動相為體積分數95％的正己烷和體積分數5％的乙醇。轉化率分析使用C18柱(4.6mm×250mm，Diamonsil，ShanghaiDIKMACo.Ltd)，流動相為體積分數55％的乙腈和體積分數45％的水。檢測器波長均為210nm，柱溫為30℃。
將含有KpADH重組質粒的大腸杆菌接種到LB培養基中，並加入50μg/mL的卡那黴素(Kan)，在37℃和180r/min下振蕩培養。當OD600達到0.8時，加入異丙基書-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，0.2mol/L)至終濃度0.2mmol/L。並將溫度降低至25℃誘導蛋白質表達。培養結束，通過離心收集細胞並在PBS緩衝液(pH7.4)中進行超聲破碎。將細胞裂解液以8000r/min離心30min。最後，通過親和色譜法純化細胞裂解液，並通過SDS-PAGE分析。
將KpADH的純酶液稀釋至1mg/mL左右，取稀釋的酶液1mL放入30℃恒溫水浴鍋中保溫。定時取樣並采用上述1.3的測活方法。以Oh的活力為100％，依次測定比活力隨時間變化的曲線，活力下降到50％的時間為該蛋白質在30℃的半衰期。
采用純酶液測定硒ADH的動力學參數，使用上述1.3的測活方法，測定不同濃度底物(0.5～50mmol/L)和產物(0～100mmol/L)的比活力，使用0rigin軟件分別進行非線性回歸擬合。擬合方程包括：米氏方程、競爭性抑製方程、非競爭性抑製方程、反競爭性抑製方程、混合性抑製方程；並獲得參數抑製常數Ki、米氏常數Km、最大反應速率Vmax，采用0rigin評估擬合結果並通過MatLab軟件作圖。以上所有數據均獨立測定3次。
反應在20mL的磁力攪拌夾套反應器中進行,將1g底物、1.2g葡萄糖、20mg葡萄糖脫氫酶凍幹酶粉、35mgKpADH凍幹酶粉及不同助溶劑分別加入10mL反應體係中，30℃恒溫條件下反應，並采用自動滴定儀滴定1mol/LNa2CO3，使pH維持在7.0。反應進程中定點取樣，通過液相色譜分析獲得轉化率及終產物的對映體過量值(e.e.值)。
準確配製lmol/L的NBP0及NBHP，取20μL加入480μL緩衝液中，再按照體積比1：1加入有機溶劑，吸取200μL水相，加入400μL乙酸乙酯萃取並烘幹，通過液相色譜分別計算出底物及產物的濃度。分配係數等於底物NBP0和產物NBHP分別在有機相和水相濃度的分配比。每個樣品分別做3個平行。
將純化的KpADH酶液(保持蛋白質質量濃度在1mg/mL左右)與有機溶劑按體積比1:1混合，在30℃和1000r/min條件下振蕩並保溫12h，吸取水相中的酶液采用1.3的測活方法，進行殘餘活力的測定。
反應在20mL的磁力攪拌夾套反應器中進行，將2g底物、2.4g葡萄糖、40mg葡萄糖脫氫酶凍幹酶粉、70mg腳ADH凍幹酶粉分別加入10mL反應體係中，30℃恒溫反應，並采用自動滴定儀滴定lmol/LNa2C03，使pH維持在7.0。反應結束後，采用二氯甲烷將反應液萃取3次，收集萃取後的二氯甲烷，並通過旋轉蒸發儀揮發二氯甲烷，獲得產品(S)-NBHP。采用HPLC分析產品的立體選擇性。
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