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柚皮苷二氢查尔酮的抗氧化活性研究(一)

来源:时间:2025-04-22 03:14:24

1963年,柚皮俞福惠等發現二氫查爾酮及其衍生物可作為甜味劑,苷氢並從柑橘黃烷酮中提取了柚皮苷二氫查爾酮(NariNgiNDC)等。抗氧二氫查爾酮的化活甜味持續時間長,口感清爽,性研甜度高,柚皮熱量低,苷氢安全無毒,抗氧能有效的化活屏蔽苦味。二氫查爾酮類化合物對糖尿病有一定作用。性研此外,柚皮二氫查爾酮類化合物具有藥效基團-2,苷氢6-二羥基苯乙酮結構,抗氧該基團有抗氧化作用,化活通過消除過氧化物、性研清除羥自由基來實現。歐陽振宇以柚皮渣為原料,超聲波輔助提取柚皮苷,並用D101大孔樹脂分離富集,得到純度為83.7%的柚皮苷;對柚皮苷在堿性條件下加壓並以鈀碳作為催化劑合成柚皮苷二氫查爾酮(NariNgiNDC),產率為85.2%。文獻和以超聲波輔助乙醇提取香柚皮中的柚皮苷,並用弱極性AB-8樹脂分離純化柚皮苷,NaOH作為洗脫劑,得到純度為77.26%的柚皮苷堿溶液,最後將該堿液在催化劑雷尼鎳的作用下,加氫合成NariNgiNDC。李晚誼等研究表明雲南甜茶有強的過敏作用,其抗過敏作用的有效成分是二氫查爾酮-4’-β-D葡萄糖苷和二氫查爾酮-2’-β-D葡萄糖苷。方旭兵等研究表明龍血樹醇提取物龍血竭的主要成分——龍血素A和龍血素B均為二氫查爾酮類化合物,經對相關二氫查爾酮合成和修飾以及用HepG2細胞進行抗肝癌腫瘤活性篩選,發現二氫查爾酮類化合物中F-18和F-16抗肝癌腫瘤活性較好。楊美琪研究表明利用矽膠、大孔樹脂、MCi-CHP20P及葡聚糖凝膠柱等分離方法,結合薄層色譜及HPLC分析木棗棗根醇提物,得到含量較高的二氫查爾酮-4’-β-D-吡喃葡萄糖苷等16個化合物。目前,NariNgiNDC的活性研究報道較少,本研究對其抗氧化活性和美白活性進行初步探討。

1材料與方法

1.1材料、試劑與設備

柚皮苷標準品,上海源葉;NariNgiNDC標準品,上海源葉;新橙皮苷二氫查爾酮標準品,上海源葉;ABTs,碧雲天生物;酪氨酸酶,上海源葉;其它試劑均為分析純;AuTodoCkviNa1.1.2,美國sCripps研究所。EL204-iC分析天平,美國METTLERTOLEDO公司;5ML移液槍,美國EppeNdorF公司;syNergyTX多功能酶標儀,美國伯騰儀器有限公司;MuLTiskaNGo全波長讀數儀,美國TherMosCieNTiFiC公司。

1.2試驗方法

1.2.1ABTs自由基清除能力測定

通過3.0Mg/ML柚皮苷、1.0Mg/MLNariNgiNDC、0.30Mg/MLNHDC、0.0025Mg/ML槲皮素與ABTs自由基反應,測定其吸光值,繪製TroLox(0.15,0.30,0.60,0.90,1.20,1.50MMoL/L)標準曲線,計算其與TroLox的相同清除能力時的用量。具體操作步驟:

1)在96孔板的每個檢測孔中加入200μLABTs工作液。

2)空白對照孔中加入10μL蒸餾水或PBs等適當溶液,標準曲線檢測孔內加入10μL各種濃度的TroLox標準溶液,樣品檢測孔內加入10μL樣品,輕輕混勻。

3)室溫孵育2~6MiN,於波長734NM處測定吸光度。

4)根據標準曲線計算樣品的總抗氧化能力,用TroLox等效抗氧化能力(TroLoxEquivaLeNTANTioxidaNCapaCiLy,TEAC)來表示。

1.2.2羥自由基清除能力測定

通過3.0Mg/ML柚皮苷、1.0Mg/MLNariNgiNDC、0.50Mg/MLNHDC、0.15Mg/ML槲皮素與羥自由基反應,測定其吸光值,繪製TroLox(0.01,0.025,0.05,0.10,0.15Mg/L)標準曲線,計算其與TroLox的當量,進而比較抗氧化能力強、弱。

按照表1所列順序向酶標板中加入對應試劑,按表1規定的條件操作,以TroLox為標準品繪製標準曲線。

樣品的抗氧化能力根據式(1)進行計算。抗氧化能力值以TroLox相同抗氧化能力時的用量(μMoLTroLox物質的量/g)表示,即1g樣品相當於TroLox的μMoL數。

式中,A樣品—樣品吸光度;A空白—樣品空白吸光度;ATroLox—TroLox溶液吸光度;MTroLox—TroLox溶液的物質的量(μMoL);M樣品—樣品的質量(Mg)。

FerriC-TPTZ工作液[300MMoL/L醋酸鹽緩衝液(0.31g三水合醋酸鈉+1.6ML冰醋酸+超純水至100ML,pH3.6]、10MMoL/LTPTZ的40MMoL/鹽酸溶液和20MMoL/LFeCL3·6H2O溶液,以體積比10∶1∶1混合),室溫反應30MiN後,於波長593NM處用酶標儀測定其吸光度。吸光值的大小與樣品的抗氧化能力成正比。維生素C的標準曲線配製濃度為:25,50,100,200,400,800μMoL/L,測定結果以維生素C為參考標準,結果表示為μMoLAAE/g幹重。平行測定3次,結果取平均值計算。

1.2.4 ORAC法測定樣品的氧自由基清除能力

通過3.00g/L柚皮苷、1.00g/LNariNgiNDC、3.00g/LNHDC、0.0125Mg/ML槲皮素與過氧自由基反應,測定其吸光值,繪製TroLox(62.5,125,250,500,500,1000MoL/L)標準曲線,計算其與TroLox的物質的量,比較抗氧化能力強、弱。

該方法以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由基來源,熒光素鈉鹽為熒光指示劑。將熒光素鈉鹽、AAPH和水溶性維生素C類似物TroLox分別用磷酸鹽緩衝液(pH7.0)溶解,在96孔板中依次加入25μL各濃度的TroLox標準品溶液和樣品以及200μL熒光光素鈉鹽溶液(8.68NMoL/L),然後,將孔板放入熒光酶標儀中,用GeNe5軟件編程操作,37℃預熱30MiN,迅速加入AAPH溶液25μL(153MMoL/L),自動振蕩搖勻,在激發波長485NM,發射波長528NM處用熒光酶標儀測定。初始吸光強度值記為f0,以後每隔1MiN測定一個點,共測定120MiN,熒光強度分別記為f0,f1,f2…f120,根據公式(2)統計各濃度的曲線下麵積AUC值。ORAC的含量越高,抗氧化能力越強。

TroLox標準曲線配製濃度分別為62.5,125,250,500,1000μMoL/L,測定結果以TroLox為參考標準,結果表示為μMoLTroLox(TE)/g幹重。平行測定3次,結果取平均值計算。

1.2.5 NariNgiNDC與人銅鋅超氧化物歧化酶sOD的分子對接

采用CheMBioDrawULTra14.0畫出化合物槲皮素和NariNgiNDC的結構,然後用CheMBio3DULTra14.0轉化為三維結構,並用sybyL軟件的MMFF94力場進行優化。人銅鋅超氧化物歧化酶sOD的三維結構(PDBiD:3RE0)從RCsB蛋白數據庫下載。銅鋅超氧化物歧化酶和化合物均使用AuTodoCkTooLs1.5.6轉化為PDBQT格式。采用AuTodoCkviNa1.1.2進行分子對接。銅鋅超氧化物歧化酶活性位點的坐標設置為:size_x=15,size_y=15,size_z=15;CeNTer_x=1.346,CeNTer_y=-3.077,CeNTer_z=30.419。為了增加計算的準確度,將參數exhausTiveNess設置為20。除了特別說明,其它參數均采用默認值。最後,選取打分值最高的構象用PyMoL1.7.6進行結果分析。1.2.6酪氨酸酶活性抑製試驗通過熊果苷(0.625,1.25,2.5,5,10Mg/ML)、柚皮苷(0.625,1.25,2.5,5,10Mg/ML)、NariNgiNDC(0.625,1.25,2.5,5,10Mg/ML)、NHDC(0.625,1.25,2.5,5,10Mg/ML)與酪氨酸酶反應測定其吸光值並繪製曲線,求出iC50值,進而比較抗氧化能力強、弱。

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