根據2.1薄層色譜鑒別條件，薄层别槐建立槐枝的色谱色谱薄層色譜鑒別方法：稱取槐枝粉末（過二號篩）2g，加入石油醚（30～60℃）30mL超聲處理20min，法鉴法测過濾，枝及中芦棄去濾液，高效濾渣揮幹溶劑後，液相加入50mL甲醇超聲處理（500W，定其丁含頻率40kHz）30min，薄层别槐過濾，色谱色谱取濾液蒸幹，法鉴法测加入2mL甲醇溶解殘渣，枝及中芦即為供試品溶液。高效按1.2.1方法製備對照品溶液。液相按照薄層色譜法（2020年版《中國藥典：四部》 通則 0502）試驗方法，定其丁含分別吸取供試品溶液和對照品溶液各2μL，薄层别槐分別點於同一矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯–甲醇–甲酸–水（體積比為8∶1∶1∶1）溶液為展開劑，展開，取出，晾幹，噴三氯化鋁試液，待乙醇揮幹後，置於紫外光燈（365nm）下檢視，結果如圖2所示。由圖2可以看出，供試品色譜圖在與對照品色譜圖相應位置上，呈現相同顏色的熒光斑點。
分別精密吸取1.3.2中的對照品溶液和1.3.3中的供試品溶液，各10μL，按1.3.1色譜條件測定，理論板數按蘆丁色譜峰計不低於3000，係統適應性試驗符合要求。對照品溶液、供試品溶液色譜圖如圖3所示。
選擇編號為1＃的槐枝樣品粉末，分別選擇甲醇、70%乙醇溶液、50%甲醇溶液及50%乙醇溶液4種提取溶劑對蘆丁進行提取，考察不同提取溶劑的提取效果。結果發現以50%甲醇溶液為提取溶劑時，色譜峰麵積最大，基線平穩，故采用50%甲醇為提取溶劑。以50%甲醇溶液為提取溶劑，分別采用超聲法（30、60min）、回流法（30、60min）對蘆丁進行提取，考察不同提取方法的提取效果。結果發現超聲提取（30、60min）及回流提取（30、60min）的色譜峰麵積無明顯差異，故選用超聲法（30min）對樣品進行提取。
分別選用瑞典Nouryon的Kromasil100–5–C18(250mm×4.6mm，5.0μm)色譜柱、島津企業管理（中國）有限公司的VP–ODSC18(250mm×4.6mm，5.0μm)色譜柱及美國安捷倫科技有限公司的AgilentZorbaxSBC18(250mm×4.6mm，5.0μm)色譜柱進行試驗，發現不同色譜柱之間無明顯差異，均能實現色譜分離，理論板數，分離度及拖尾因子均符合《中國藥典》2020年版的規定。本實驗選用瑞典Nouryon的Kromasil100–5–C18(250mm×4.6mm，5.0μm)色譜柱作為分離柱。
在1.3.1色譜條件下，分別考察了甲醇–0.01mol/L乙酸銨(體積比為47∶53)溶液、甲醇–1%冰醋酸（體積比為32∶68）溶液、乙腈–2.5%冰醋酸（體積比為13∶87）溶液3種流動相係統。結果發現采用乙腈–2.5%冰醋酸溶液作為流動相時，色譜圖中的溶劑峰明顯；采用甲醇–0.01mol/L乙酸銨溶液、甲醇–1%冰醋酸溶液作為流動相時，蘆丁的色譜峰尖銳，理論板數高，分離度良好。由於甲醇–0.01mol/L乙酸銨溶液配製較複雜，使用鹽溶液操作不當容易阻塞色譜柱，損壞高效液相色譜儀，而甲醇–1%冰醋酸溶液配製簡單，操作容易。綜合考慮，選擇甲醇–1%冰醋酸（體積比為32∶68）溶液為流動相。
自動進樣器分別精密吸取1.3.2中的對照品溶液3、7、10、13、15μL注入液相色譜儀，在1.3.1色譜條件下，依次進樣測定，以蘆丁的質量為橫坐標，以色譜峰麵積為縱坐標繪製標準曲線，計算線性方程和相關係數。
用甲醇將對照品溶液稀釋10倍，然後逐級稀釋進樣分析，以3倍信號和噪音的比值（S/N）對應的質量作為方法檢出限，5倍信噪比對應的質量作為定量限。蘆丁的線性範圍、線性方程、相關係數、檢出限及定量限見表1。
選擇1號槐枝樣品粉末（過二號篩），精密稱取約0.5g，按照1.3.3方法製備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下，分別於製備完成後第0、1、2、3、5、7、10、12、24h進樣測定，結果見表2。由表2可知，在24h內色譜峰麵積測定結果的相對標準偏差為0.19%，表明樣品溶液在24h內穩定性較好。
取1號槐枝樣品粉末（過二號篩）6份，每份約0.5g，精密稱定，按照1.3.3方法製備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下分別進樣測定，結果見表3。由表3可知，色譜峰麵積測定結果的相對標準偏差為1.6%，表明該方法精密度較好，滿足測定要求。
精密稱取1號槐枝樣品粉末（過二號篩）6份，每份約0.25g，分別加入質量濃度為7.54μg/mL的蘆丁對照品溶液20mL，再精密加入25mL水和5mL甲醇，密塞，稱量並記錄溶液質量，超聲處理（500W，頻率40kHz）30min，冷卻，再次稱量溶液質量，用50%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，在1.3.1色譜條件下分別進樣測定，結果見表4。由表4可知，樣品加標回收率為98.7%～102.2%，測定結果的相對標準偏差為1.4%，表明該方法準確度較高。
分別精密稱取1～10號槐枝樣品粉末（過二號篩），各約0.5g，按1.3.3方法製備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下分別進樣測定，結果見表5。
由表5可知，10批槐枝樣品中蘆丁的質量分數在0.10%～0.16%之間。不同槐枝樣品之間蘆丁含量差異較大，可能是在槐枝采集過程中，存在以老枝摻入嫩枝入藥的情形，而老枝中蘆丁的含量較低。
樣品先加石油醚（30～60℃）脫色，然後用甲醇進行提取，以乙酸乙酯–甲醇–甲酸–水（體積比為8∶1∶1∶1）為展開劑，顯色後斑點清晰，分離度好，可用於槐枝的定性鑒別。采用50%甲醇作為提取溶劑，以甲醇–1%冰醋酸溶液（體積比為32∶68）為流動相，建立了高效液相色譜法測定槐枝中蘆丁含量的方法。該方法簡便易行、準確可靠，可為槐枝質量控製提供技術支持。
相關鏈接：乙酸乙酯，石油醚，蘆丁，冰醋酸
聲明：本文所用圖片、文字來源《化學分析計量》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
