醬油因其味道鮮美、强化口感醇厚，嗜盐成為人們餐桌飲食的联球重要調味品。目前，菌对酱油國內外的模拟醬油釀造工藝主要有低鹽固態工藝和高鹽稀態工藝兩種。低鹽固態發酵工藝最初是低盐的影為了改善無鹽固態發酵醬油的風味而提出的，此工藝具有發酵溫度高、发酵能夠抑製雜菌、强化原料利用率高和生產穩定的嗜盐優點，並且周期較短、联球易於大規模生產，菌对酱油是模拟我國大部分醬油生產企業主要釆用的發酵工藝。但是低盐的影相較於高鹽稀態發酵工藝，酶作用周期比較短，发酵酯香味不足，强化生產的醬油以中低檔為主。

高鹽稀態發酵工藝是把原料經過蒸煮或焙炒、製曲後與20%左右的鹽水混合成醬醪，經過發酵製成醬油。該工藝雖然周期長、原料利用率低，但是後發酵充分、味醇香濃，是廠家生產高檔醬油的首選工藝。但是高鹽稀態醬油中較高的鹽濃度（18%～22%）存在引發高血壓、心血管等疾病的潛在危險，可能會影響人體健康。食品法典委員會（codexalimentariuscommission,CAC）建議將飲食中鹽的攝入量從9g/d減少到6g/d，世界衛生組織（worldhealthorganization,WHO）和糧食及農業組織（foodandagricultureorganization,FAO）建議每日鹽攝取量不超過5g/d。所以食用低鹽發酵醬油已成為一種趨勢，提高低鹽發酵醬油的品質已成為行業內亟待解決的問題。

醬油發酵是典型的混菌發酵過程，多種微生物參與其中並發揮作用，主要有曲黴、酵母菌、乳酸菌以及其他細菌，其中酵母菌和乳酸菌在醬油發酵過程中發揮重要作用。魯氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）、埃切假絲酵母（Candidaetchellsii）和易變球擬酵母（Torulopsisversatilis）與醬油發酵的關係最為密切，其中研究和應用最多的是魯氏接合酵母。魯氏接合酵母是醬醪中的優勢微生物，主要作用於醬油發酵前期，除了能生成多種醇類，還能參與含硫化合物等風味物質的形成，帶給醬油更加複雜和醇厚的香氣。目前，人工添加魯氏接合酵母的效果明顯、技術成熟，並受到了一致認可。

乳酸菌種類多、總量大，能夠發酵葡萄糖生成酸類物質，是影響醬油發酵的重要微生物。嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcushalophilus）是一類參與醬油發酵的耐鹽乳酸菌。嗜鹽四聯球菌具有多種氨肽酶，能參與氨基酸的次級代謝和醇醛之間的轉化。在醬油生產過程中強化嗜鹽四聯球菌和酵母菌，能通過菌株間的協同作用使醬油風味更加豐富。已有研究表明，添加兩種酵母菌（Z.rouxii和皺狀假絲酵母（Candidaversatilis））和嗜鹽四聯球菌可使醬油中醇類、酯類、酸類和吡嗪類等物質含量顯著增加，揮發性物質總量提高2.2倍。嗜鹽四聯球菌對低鹽醬油防腐有著一定的積極意義，其能夠利用葡萄糖產生高濃度乳酸。乳酸不僅能賦予醬油柔和的酸味，而且醬油發酵過程中維持一定濃度的乳酸能有效抑製巨大芽胞杆菌（Bacillusmegatherium）為主的醬油變質脹瓶汙染菌，有利於成品醬油的質量安全。另外，嗜鹽四聯球菌還能減少胺類危害物的含量。

研究發現，酵母菌和乳酸菌在醬醪中存在通過物質代謝產生的拮抗作用，乳酸菌和酵母菌的添加需要有一定的間隔期，並且其添加量對醬醪發酵也有顯著影響。本研究以通過模擬低鹽醬油快速發酵，在添加魯氏接合酵母的基礎上，考察嗜鹽四聯球菌不同添加量對醬醪理化指標、氨基酸和有機酸含量、揮發性風味物質等的影響，揭示其發酵功能，為提高低鹽發酵醬油品質提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

醬油曲精（米曲黴（Aspergillusoryzae）滬釀3.042）：久味食品科技有限公司；嗜鹽四聯球菌R44、魯氏接合酵母ZQ02：分離自新鮮醬醪，保存於本實驗室。

1.1.2培養基

嗜鹽四聯球菌培養基采用MRS肉湯培養基：英國Oxoid公司。使用時添加NaCl100g/L,pH7.0。固體培養基中添加瓊脂20g/L。

魯氏接合酵母培養基采用酵母浸出粉腖葡萄糖培養基（yeastextractpeptonedextrose,YPD）：北京索寶來科技有限公司。使用時添加NaCl50g/L,pH5.0。固體培養基中添加瓊脂20g/L。

嗜鹽四聯球菌計數培養基采用MRS固體培養基：英國Oxoid公司。使用時添加納他黴素0.1g/L、NaCl100g/L,pH7.0。

酵母菌計數培養基[5]采用孟加拉紅固體培養基：青島寶博生物科技有限公司。使用時添加丙酸鈉5g/L、NaCl100g/L,pH5.0。

以上培養基均115℃滅菌30min。

1.1.3試劑

酵母膏、胰蛋白腖（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；氨基酸標樣、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde,OPA）（色譜純）：美國Agilent公司；納他黴素（純度96%）：青島寶博生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

867pH計、ME204電子天平：瑞士Mettler-Toledo公司；MultiskanFC酶標儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；PegasusGC-HRT4D+氣相-高通量飛行時間質譜儀：美國力可公司；UV-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；1260高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）儀：美國安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1菌株培養

嗜鹽四聯球菌的培養：從甘油管中取適量嗜鹽四聯球菌菌液，接種至嗜鹽四聯球菌固體培養基，30℃活化培養5d。從活化平板上挑取單菌落接種到嗜鹽四聯球菌液體培養基中，30℃靜置培養60h，按1%(V/V）的接種量接種至嗜鹽四聯球菌液體培養基，30℃靜置培養至OD600nm值達到1.2（菌體濃度1.2×10⁸CFU/mL），備用。

魯氏接合酵母的培養：從甘油管中取適量魯氏接合酵母菌液，接種至魯氏接合酵母固體培養基，30℃活化培養2d。從活化平板上挑取單菌落接種到魯氏接合酵母液體培養基中，30℃、220r/min培養30h，按1%(V/V）的接種量接種至魯氏接合酵母液體培養基，30℃、220r/min培養至OD600nm值達到4.0（菌體濃度6.4×10⁷CFU/mL），備用。

1.3.2模擬低鹽醬油快速發酵工藝

製曲工藝：將黃豆粉和1.2倍的水混合均勻後在121℃下滅菌15min，冷卻至室溫後，把黃豆粉、炒熟的小麥粉（質量比為6∶4）和醬油曲精（原料總質量的1.5‰）充分拌勻。在生化培養箱中30℃培養48h，適時翻曲，曲料表麵長滿菌絲即為成曲。

發酵工藝：將成曲用研缽碾碎，與鹽水（100g/LNaCl）以體積比1.0∶2.5混合。將混合後的醬醪分裝入2L壇子中，30℃發酵30d，期間每天攪拌一次。在發酵第0、5、10、15、20、25和30天進行取樣。

菌株的添加方式及添加量：模擬低鹽醬油快速發酵過程菌株的添加方式及添加量見表1。發酵開始時（pH5.2左右）添加10⁷CFU/g魯氏接合酵母ZQ02(Z)。嗜鹽四聯球菌添加時間為發酵10d，添加量分別為10⁶CFU/g(Z+T(10））、10⁷CFU/g(Z+10×T(10））、10⁸CFU/g(Z+100×T(10））。

1.3.3嗜鹽四聯球菌和酵母菌數量的測定

采用平板計數法測定嗜鹽四聯球菌和酵母菌數量。稱取1g新鮮醬醪和99mL生理鹽水混勻，梯度稀釋後塗布到計數培養基上，30℃培養3～6d進行計數。嗜鹽四聯球菌為兼性厭氧菌，菌落較小，平板培養需要4～6d。因此，MRS平板計數時可以和醬醪中優勢耐鹽細菌（包括魏斯氏菌（Weissella）、芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus））區分。本方法所計算的酵母數量包括添加的魯氏接合酵母以及醬醪中的其他耐鹽酵母，後者與前者相比數量較少，可忽略不計。

1.3.4醬醪理化指標的測定

取100g醬醪，12000r/min離心30min，用孔徑為0.22μm的濾膜過濾上清液後進行測定。醬醪pH值采用精密pH計測定。總酸含量采用酸度計法測定。還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylicacid,DNS）測定。氨基酸態氮含量采用甲醛滴定法測定。

1.3.5醬醪遊離氨基酸的測定

遊離氨基酸采用高效液相色譜法測定，采用OPA進行柱內衍生化，具體測定方法參照文獻。

1.3.6醬醪有機酸的測定

有機酸采用高效液相色譜法測定，具體方法參考文獻。

1.3.7醬醪揮發性風味物質的測定

揮發性風味物質采用頂空固相微萃取（headspacesolidphasemicro-extraction,HS-SPME）聯合氣質聯用技術（gaschromatography-massspectrometer,GC-MS）進行測定，具體方法參考文獻。測定後將樣品質譜圖與美國國家標準與技術研究院（nationalinstituteofstandardsandtechnology,NIST)2.0標準譜庫比對鑒定，根據保留指數（retentionindex,RI）對揮發性物質進行定性，根據內標2-辛醇（83.36μg/L）的峰麵積對揮發性物質進行半定量分析。

1.3.8數據處理方法

利用Excel2012、SPSS19.0對數據進行處理分析，利用Origin8.5、R語言和AdobeillustratorCS6對數據可視化。所有試驗均重複3次，結果采用“均值±標準差”的形式展示。

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