金櫻子（RoselaevigataMichx），金樱及其究別名刺榆子、棕色金罌子、抗氧山石榴、化活金壺瓶、性研燈籠果等，金樱及其究為薔薇科常綠攀緣植物，棕色主產於廣東、抗氧廣西、化活湖南、性研江西、金樱及其究浙江、棕色江蘇、抗氧安徽等地，化活均為野生。性研成熟的金櫻子含有多糖、黃酮類、三萜類及其衍生物等各種化學成分。其用途廣泛，可用來釀酒、熬糖、加工飲料等。其提取物金櫻子棕色素初步推斷為黃酮類化合物，這類物質具有良好的抗氧化活性功能，可通過清除自由基達到抗氧化效果。本文以金櫻子為原料，探索出一條提取金櫻子棕色素的新的工藝路線，該路線簡單易行，避免了使用毒性有機溶劑，可用於工業化生產。同時本文采用FRAP法和DPPH法，以維生素C和BHT為對比物，初步探討了金櫻子棕色素的抗氧活性的能力。采用熒光和化學發光法測定色素清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，以及其抑製亞油酸脂質過氧化的作用，為提高金櫻子棕色素的利用價值提供依據。
一、實驗部分
1、實驗材料
（1）實驗原料與試劑
金櫻子幹果（購自當地藥店）；FeCl3、Fe-SO4、HCI、維生素C、H2O2、苯甲酸、醋酸、醋酸鈉、無水乙醇、95％乙醇、羅丹明B、三羥甲基氨基甲烷、二丁基羥基甲苯（BHT），以上試劑均為國產分析純試劑；魯米諾（1uminol，Merck公司）；鄰苯三酚（Merck公司）；三吡啶三吖嗪（tripyridyhriazine，TPTZ，Sigma公司）；二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，Sigma公司）。試驗用水均為二重蒸餾水。
（2）實驗儀器
UV-1700紫外-可見分光光度計、微弱化學發光儀（尤尼柯（上海）器有限公司）；CaryEclipse熒光分光光度計（美國瓦裏安公司）；BS200s電子分析天平（上海天平儀器廠）；超濾膜（自製）；AB-8大孔吸附樹脂（南開大學化工廠）；旋轉蒸發儀RE52A（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6050型真空幹燥箱（上海博迅實業有限公司）。
2、實驗方法
（1）金櫻子棕色素的提取工藝
金櫻子→去雜→幹燥→粉碎→石油醚脫脂→乙醇水溶液浸提→過濾→濾渣→二次浸提→濾渣
（2）FRAP法測定金櫻子棕色素總抗氧化能力
FRAP法是基於氧化還原反應的比色法。在較低的pH條件下Fe3+三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被試樣中還原物質還原為Fe2+形式，呈現出藍色，在波長593nm處具有最大光吸收，根據吸光度大小計算樣品抗氧化活性的強弱。
分別配製0.1g／L的金櫻子棕色素、BHT及維生素C溶液作為樣品，FRAP工作液為10.0mmol／LTPTZ溶液、20.0mmol／LFeCl3溶液和0.3mmol／L醋酸鈉緩衝液以1∶1∶10組成的混合物。用微量移液器分別精確吸取色素溶液、BHT溶液、維生素C溶液0.1mL，分別加入預熱至37℃的1.80mLTPTZ工作液混勻，終反應液用各自溶劑補足至5.00mL，37℃反應10min，分別以各自溶劑為空白對照，測定593nm處的吸光度值（A），以1.00mmol／LFeSO3為標準，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數表示。
FeSO4標準曲線的製備：精密移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mmoVLFeS04標準溶液各0.10mL分別置於5隻微量試劑瓶中，分別加入預熱至37℃的1.80mLFRAP工作液並用蒸餾水補足至5.0mL，混勻，37℃反應10min，以試劑做空白，在波長593nm處測定吸光度值，以吸光度值（A）為縱坐標，濃度為橫坐標，計算回歸方程。
（3）DPPH法測定金櫻子棕色素抗氧化活性
DPPH是一種穩定的有機自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可見光區最大吸收峰為517nm。當DPPH溶液中加入自由基清除劑時，溶液顏色變淺，A517nm。值變小，而且吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關係。因此可用自由基的清除情況來評價某物質的抗氧化能力，其抗氧化能力用清除率來表示，清除率越大，抗氧化能力越強。
先用無水乙醇配製2×10-4mol／L的DPPH·溶液，同時分別稱取一定量金櫻子棕色素、BHT和維生素C用蒸餾水溶解，並將其稀釋為以下濃度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.059／L，作為測試液。用微量移液器精確吸取測定液2.0mL與DPPH溶液2.0mL混合，搖勻後放置30min，以無水乙醇為對照，測定波長517nm處的吸光度值AO同時測定2.0mLDPPH·溶液與2.0mL無水乙醇混合液的吸光度Ao，以及2.0mL測定液與2.0mL無水乙醇混合液的吸光度A1，根據下列公式計算測定液對DPPH·的清除率。按以上測試方法分別測定其清除率，得出直線回歸方程，進而計算其50％清除率（IC50）。
清除率=[1一（A—A1）／Ao×100％
式中：A為加測試液後DPPH的吸光度；A1為測定液在測定波長吸光度；Ao為未加測定液時DPPH的吸光度。
（4）金櫻子棕色素清除超氧陰離子的能力
采用魯米諾—鄰苯三酚體係。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速的發生自氧化，產生一係列的有色產物。鄰苯三酚與魯米諾體係為快速發光，能在鄰苯三酚自氧化速率呈線性的時間內達到發光峰值。色素中的抗氧化物質可以抑製超氧陰離子，降低其濃度，從而減弱發光強度。發光強度的降低值與色素中抗氧化物質清除O2-自由基的能力成正相關，因此，可以間接地測定色素對O2-自由基清除的能力。
在測定管中加入1.0mmoL／L魯米諾（用0.1mol／L的碳酸鈉溶液配成）2.OmL，加入不同量的色素（水乳濁液）溶液（或用同體積的雙蒸水做空白），再注入20μL蒸餾水，最後加入10.0mmol／L鄰苯三酚20μL起動反應，快速混勻，立即置入樣品室中，在319.5nm波長處每間隔lmin測吸光值一次，共反應5min。每個樣品平行做三次，取平均值，按下式計算清除率。
清除率=（CL0-CL）／CLo×100％
式中：CL0為空白試驗吸光度；CL為測試液吸光度。
（5）金櫻子棕色素清除羥自由基的能力
采用羅丹明B-Fenton體係。Fenton反應是以過氧化氫為氧化劑，以亞鐵鹽為催化體係的氧化反應方法，在反應中可產生羥自由基（·OH）。羅丹明B是一種熒光染料，本身能產生特征熒光，其激發波長和發射波長分別為358nm和575nm。Fenton反應體係產生的·OH可以迅速氧化羅丹明B，使羅丹明B的熒光強度顯著降低，從而間接測定羥自由基的產生量。
羥自由基檢測：在測試管中依次加入Tris—HCL緩衝溶液（pH5.5）6.0mL，1.92×10-3mmol／L羅丹明B溶液19.2uL，4.08mmol／LH202溶液0.48mL，0.64mmol／LFeS04溶液1.28mL，搖勻，反應5min後，用蒸餾水補足終體積至10.0mL。15min後在358nm激發波長下測定575nm處的熒光強度F，計算其與空白參比（羅丹明B與緩衝溶液）熒光強度F0之差△F。
在上述體係中，加入不同濃度的色素水乳濁液，測定熒光強度Fs；未加Fenton試劑與色素的體係為空白體係，測定熒光強度F0；則清除率按以下公式計算。
清除率=（F0一Fs）／F0×100％
（6）金櫻子棕色素抑製亞油酸脂質過氧化作用
Fe2+／亞油酸體係中，過渡金屬離子如Fe2+等，可以通過多種途徑促進脂質過氧化反應的進行。亞油酸是多不飽和脂肪酸，暴露在有氧環境中會發生自動氧化，實驗時提高環境溫度可以加速其氧化過程，通過測定其添加樣品後的過氧化水平，並與空白對照比較，可以評價樣品的抗脂質過氧化活性。
2mL樣品溶液加入亞油酸乳濁液2.5mL，2.5mL磷酸鹽緩衝液（0.2mol／L，pH7.0），0.1mL501xmol／L的氯化亞鐵溶液，0.1mL50μmoL／L的維生素C溶液，37℃保溫24h，每8h取0.1mL加入5mL75％乙醇，0.1mL30％的硫氰酸銨，0.1mL20mmol／L的氯化亞鐵的3.5％HCL溶液（新鮮配製），室溫下放置3min，磷酸鹽緩衝液調零，以不加樣品為空白，500nim下測定吸光度。抑製率計算公式：
抑製率（％）=（A空白一A樣品）／A空白×100
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