花椒是高效指芸香科青椒和紅花椒等去除種子和雜質的幹燥成熟果皮，主要是液相作為中藥和食物調味品。花椒在全世界250多種，色谱主要分布於亞洲、定量的建非洲、检测美洲及大洋洲的花椒含量熱帶及亞熱帶地區，亞洲是麻味花椒主產區，中國約有45種，物质13個變種。高效花椒在我國栽培曆史悠久，液相在我國的色谱應用已有兩千餘年的曆史，它有一定的定量的建藥效成分，有殺蟲、检测止癢、花椒含量抑菌、麻味抑製血小板凝集、抗氧化等作用。花椒中的主要化學成分有酰胺、生物堿、木脂素、揮發油等。

酰胺類物質是花椒的主要麻味成分，也是花椒主要的風味物質。目前，從花椒中分離得到的麻味物質總共25種，為一類鏈狀不飽和脂肪酰胺物質，其中山椒素是代表性的麻昧物質，具有強烈的刺激性，結晶後為白色晶體。其化學性質極不穩定，在室溫下放置幾分鍾後立刻變成黃色膠狀，易溶於甲醇和丙酮，熱乙醇，難溶於氯仿，不溶於石油醚，因此花椒酰胺類物質需在低溫低氧的條件下密封保存。由於花椒麻味物質不易保存，用HPLC法對花椒中麻味物質的檢測多在麻味物質分離純化過程中，並采用與麻味物質的結構鑒定等相結合方式，具有操作繁瑣等缺陷。目前，國內外尚未建立有關花椒麻味物質評價的標準方法，2015年版《中華人民共和國藥典》對於花椒的質量控製並沒有全麵反映花椒活性成分，也未有可用於麻味檢測的參比樣品。因此，應用HPLC法檢測花椒麻味物質含量就必須要製備標準品，這就加大了檢測其含量的難度，從而限製了花椒的質量控製及標準體係等方麵的應用。本文以實驗室自製的花椒麻味物質為標準樣品，建立了HPLC定量檢測花椒麻味物質含量方法。期望為食品工業中花椒原料的篩選提供一定的理論依據，也為花椒產品的進一步開發和研究奠定基礎。

一、材料和方法

1、實驗材料

整粒花椒樣品幹燥粉碎，過60目篩(孔徑＜O.03mm)，備用，采自全國的花椒生產基地，如四川、陝西、雲南等地；甲醇：分析純，成都科龍試劑廠；甲醇：色譜純，天津四友試劑公司。

2、主要設備

分析型高效液相色譜儀：LC-10AT型，配有紫外可見光檢測器，日本島津公司；色譜柱：HC-C18型，安捷倫公司；電子天平：FA2004型，感量O.0001，上海精密電子儀器有限公司；電熱恒溫鼓風幹燥箱：DHG-9030型，上海-恒科學儀器有限公司。

3、方法

（1）花椒麻味物質的提取

將花椒麻味物質的提取可采用有機溶劑浸提法。操作方法是：稱取一定量粉碎混勻後的花椒粉末，加入20倍的分析純甲醇於40℃～50℃水浴振蕩浸提後，離心過濾，取其上清液定容得待測樣品液。

（2）色譜條件

檢測條件：島津LC-10AT型分析型高效液相色譜儀，HC-C18型色譜柱，以1.0mL／min15min50％甲醇和水溶液梯度洗脫，10min70％甲醇和水溶液洗脫，柱溫為35℃，紫外檢測波長254nm。

（3）檢測方法

高效液相色譜(HPLC)的檢測方法：外標法。以實驗室自製的花椒麻味物質標準品為標準樣品，經甲醇溶液溶解並定容後配成一係列不同梯度的標樣溶液。分別吸取一定量的標樣注入色譜柱中，測出色譜圖中各目的物的峰麵積，然後以HPLC的峰麵積作為縱坐標，以對應的花椒麻味物質含量作為橫坐標作圖，作標準曲線。然後吸取同等量經預處理的待測樣品液，與相同條件下檢測，從色譜圖上測出花椒麻味物質的峰麵積，在標準曲線上查出所對應的待測樣品中花椒麻味物質的含量。

（4）標準曲線的繪製

準確量取標準品(55μg／mL)，采用甲醇配製成一係列質量濃度的花椒麻味物質標準溶液(μg／mL)：O、10、20、30、40、45。然後分別抽取20μg溶液進行HPLC檢測。以保留時間為22～24min的峰為目的峰，以其HPLC峰麵積為縱坐標，對應標品濃度為橫坐標，作標準曲線。

（5）方法學驗證

分別對實驗進行準確度、精密度、重複性和加標回收率的分析測定。

二、結果

1、最佳色譜分析條件的確定

經過大量的預備實驗，分析研究了柱溫對分離效果的影響。在柱溫為室溫25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、45℃等溫度進行實驗，發現柱溫為35℃時，理論塔板數最高，洗脫峰時間間隔最大。研究中還發現，花椒麻味物質含量在0～300μg／mL範圍內，花椒麻味物質的含量和響應峰的麵積具有較高的線性相關度。

（1）洗脫劑最佳流速的確定

為了探求最佳的分離條件，在紫外檢測波長254nm，柱溫35℃，用15min的50％～70％甲醇和水溶液梯度洗脫以及10min70％甲醇和水溶液洗脫，流速在0.8～1.2mL/min進行檢測，分離效果和峰形都一致(圖l，2，3)。在1.2mL／min時出峰時間最快，效率最高，但考慮到1.2mL／min時色譜柱柱壓過高，會嚴重影響色譜柱的使用年限，綜合考慮流速1.OmL/min為最佳效果。

（2）洗脫劑最佳梯度的確定

當紫外檢測波長為254nm，柱溫為35℃，流速為1.0mL／min時，采用10min的50％甲醇和水溶液梯度洗脫，15min70％甲醇和水溶液洗脫；70％甲醇等度洗脫，采用15min的50％甲醇和水溶液梯度洗脫，10min70％甲醇和水溶液洗脫；以及其他梯度洗脫進行實驗，結果表明檢測條件為15min的50％甲醇和水溶液梯度洗脫，10min70％甲醇和水溶液時，洗脫的分離效果和峰形最佳。

因此，本實驗中所確定的HPLC檢測條件為：島津LC-10AT型分析型高效液相色譜儀，色譜柱為HC-C18柱(4.6mm×250mm)，15min的50％甲醇和水溶液梯度進行洗脫，10min70％甲醇和水溶液洗脫，流速為1.0mL/min，柱溫35℃，紫外檢測波長為254nm。

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