1.3方法

1.3.1DNA提取

采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組，肠道肠埃具體方法和步驟參照試劑盒說明書。集聚菌菌所提取的性大希氏菌株DNA利用核酸蛋白分析儀和Qubit熒光定量測定儀檢測基因組DNA的純度和濃度，並送北京諾禾致源科技股份有限公司進行全基因組測序。体和

1.3.2細菌全基因組測序及生物信息學分析

經電泳檢測合格的标准DNA樣品用超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350bp的片段，經末端修複、物质加A尾、肠道肠埃加測序接頭、集聚菌菌純化、性大希氏PCR擴增等步驟完成文庫製備。体和使用Qubit2.0和Agilent2100對構建好的标准文庫進行初步定量和插入片段檢測。插入片段符合預期後，物质使用Q-PCR對文庫的肠道肠埃有效濃度進行準確定量。文庫檢測合格後采用北京諾禾致源科技股份有限公司的集聚菌菌IlluminaNovaSeq6000測序係統進行全基因組測序。對illumina測序平台的性大希氏數據進行低質量過濾，包括去除無效信號、去除測序接頭和錨定引物序列、去除複雜序列和重複序列，從而獲得高質量的有效數據（CleanData）進行後續分析。使用SOAPdenovo軟件進行組裝，用RAST對組裝序列進行注釋(http://rast.nmpdr.org)。使用基因組流行病學中心（CenterforGenomicEpidemiology）CGE的默認閾值，對組裝序列進行鑒定（http://www.genomicepidemiology.org），利用ThePathosystemsResourceIntegrationCenter（PATRIC）對基因組組成進行分析（https://www.patricbrc.org/），利用CGEVirulenceFinder在線數據庫對血清分型、MLST分型和毒力基因進行分析。

1.3.3特征性基因PCR檢測方法

將提取的CMCC44841基因組DNA定量後，分別進行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4係列濃度，參照GB4789.6-2016中引物序列和PCR檢測方法，進行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴增和靈敏度檢測，並用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.3.4標準物質的生產製備

1.3.4.1EAEC菌體標準物質的製備

取CMCC44841一代新鮮培養物，劃線接種於TSA平板，36℃培養24h。用無菌棉簽從平板上刮取菌落，加入到含有海藻糖和胎牛血清的凍幹保護劑中，渦旋混勻，用移液槍吸取20μL在低溫下速凍成球，然後於冷凍幹燥機中冷凍幹燥。將凍幹後的菌球置於2mL的西林瓶中，利用冷凍幹燥機進行真空壓蓋密封。最終製備成EAEC含量為103CFU/樣品的菌球。

1.3.4.2EAECgDNA標準物質的製備

將純度A260/A280為1.7的20µgDNA加入到20ml含有葡聚糖的凍幹保護劑中，用移液槍吸取20μL在低溫下速凍成球，然後於冷凍幹燥機中進行冷凍幹燥，最終製備成含量為20ng/樣品的菌球。將凍幹後的菌球放入2mL的西林瓶中，將膠塞虛掩的蓋在西林瓶上，然後用冷凍幹燥機進行真空壓蓋。

1.3.5標準物質均勻性測試

1.3.5.1EAEC菌體標準物質均勻性測試

根據標準物質均勻性研究抽取樣品數量要求，從製備的一批600瓶標準物質中隨機抽取20瓶樣品，每瓶樣品充分溶於1mL生理鹽水，使用螺旋塗布儀E50模式在TSA平板上進行螺旋塗布，每個樣品2個平行。36℃培養24h後對平板進行菌落計數。根據CNAS-GL003對計數結果進行單因子方差分析，評價樣品的均勻性。

1.3.5.2EAECgDNA標準物質均勻性測試

根據標準物質均勻性研究抽取樣品數量要求，從製備的一批300瓶標準物質中隨機抽取10件樣品，向每瓶標準物質樣品加入100μLddH2O，充分溶解，製備成20ng/100μL濃度的DNA樣品，取2μL作為模板，參照GB4789.6-2016中引物序列和PCR檢測方法，進行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴增。

1.3.6標準物質穩定性測試

1.3.6.1運輸穩定性

將製備的EAEC菌體標準物質和gDNA標準物質分別存放於25℃和37℃條件下，EAEC菌體標準物質模擬實驗周期為7天，分別於1、3、5、7天抽取3個樣品，進行含菌量測定。根據CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ準則對結果進行穩定性評價。EAECgDNA標準物質模擬實驗周期為14天，分別於1、3、5、7、14天抽取3個樣品，對特征性基因進行PCR擴增，考察樣品的運輸穩定性。

1.3.6.2儲藏穩定性

將製備的EAEC菌體標準物質及gDNA標準物質分別於-20℃、4℃條件下保存2個月。於4℃保存7、14和28天，-20℃保存28和60天，分別抽取3個樣品進行菌含量測定，於4℃和-20℃保存28、45和60天分別抽取3個樣品進行特征性基因檢測，考察樣品的儲藏穩定性。根據CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ準則對EAEC標準物質進行穩定性評價。

1.3.7標準物質的協作驗證

使用上述製備好的樣品，按照國家藥品標準物質協作標定實施細則，發給3家實驗室，代碼分別為A、B和C，每家實驗室收到10件樣品，參照協作驗證作業指導書對樣品中EAEC標準物質及其gDNA標準物質進行檢驗，包括菌落計數和特征性基因檢測。

1.3.8標準物質使用效果驗證

根據GB29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》，選擇熟肉製品、乳粉、腐乳、餅幹和薯片5種食品基質共20份樣品對EAEC標準物質的使用效果進行驗證，樣品信息見表1。先將EAEC103CFU濃度的標準物質溶於1mL生理鹽水中，每件樣品各稱取2份，25g/份，一份正常檢驗，一份加入標準物質100μL，根據GB4789.6-2016進行操作。增菌後劃線分離平板觀察是否有典型菌落生長，並進行PCR確認。

相關鏈接：細菌，標準物質，葡聚糖

聲明：本文所用圖片、文字來源《食品科學》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係刪除。