（6）甘草渣總黃酮抗氧化能力測定
①甘草渣總黃酮對羥自由基（·OH）清除的面优測定甘草渣總黃酮對羥自由基（·0H）清除率按照Ren的方法進行實驗。取不同濃度的化超化研甘草渣總黃酮溶液1.0mL於試管中，分別加入1.0mL10mmol/LFeSO4溶液和10mmol/L水楊酸-乙醇溶液，声提混合均勻後加入1.0mL10mmol/LH2O2溶液，取甘在37℃水浴條件下反應30min，草渣在510nm波長處測定吸光度。总黄使用蒸餾水替代H2O2作為參比對照，酮工用蒸餾水代替樣品作為空白對照，艺及計算羥自由基（·OH）清除率。抗氧另外取與提取液總黃酮同等濃度的面优維生素C溶液作為陽性對照。
式（2）中A1為樣品溶液的化超化研吸光度；A2為參比溶液吸光度；Ao為空白溶液的吸光度。
②甘草渣總黃酮對DPPH自由基清除能力的声提測定
對DPPH自由基清除能力采用Brand的方法進行測定。取1.0mL不同濃度的取甘甘草渣總黃酮提取液於試管中，分別加入5mmol/LDPPH乙醇溶液1.0mL，草渣混合均勻後暗室靜置30min，总黄取2.0mL乙醇作為空白對照，1.0mL5mmol/LDPPH乙醇溶液與1.0mL乙醇混合液作為參比對照，於517nm波長處測定吸光度，按式（3）計算DPPH自由基清除率。另外取與提取液總黃酮同等濃度的維生素C溶液作為陽性對照。
式（3）中A1為樣品溶液的吸光度；Ao為參比溶液的吸光度。
③甘草渣總黃酮總抗氧化能力測定
參考Oyaizu的方法對甘草渣總黃酮總抗氧化能力進行測定，維生素C溶液作為陽性對照。取不同濃度的甘草渣總黃酮溶液1.0mL於試管中，加入0.2mol/LpH6.6的磷酸緩衝液和1%鐵氰化鉀溶液各2.0mL後混合均勻，50℃水浴反應20min後立即冷卻至室溫，加入2.0mL10%三氯乙酸終止反應。溶液在5000r/min條件下離心10min，取上清液2.0mL，再加入2.0mL蒸餾水和0.4mL0.1%FeCl3溶液，混勻，暗室靜置反應30min後於700nm波長處測定吸光度。
（7）數據分析
用Origin9.0繪製數據圖，用Design-Expert8.0進行響應麵試驗設計和分析，所有實驗均重複3次。
二、結果與分析
1、單因素實驗結果
（1）料液比對甘草渣總黃酮收率的影響
按照精確稱取2.0g甘草渣，分別以料液比1:25（g:mL）、1:30（g：mL）、1:35（g:mL）、1:40（g:mL）和1:45（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲30min，在60℃下回流提取2h方法進行實驗，結果如圖2所示。隨著溶劑用量的增多，總黃酮的收率呈先上升後下降的趨勢。當溶劑用量較少時，總黃酮的收率隨著溶劑用量的增多而升高，可能是由於溶劑的增加使得溶液與甘草渣能夠充分接觸，促進了黃酮的溶出，從而總黃酮收率也逐漸提高。當料液比為1:35時，總黃酮收率達到最大。而當料液比過大時，總黃酮收率下降，可能是由於料液比過高，造成雜質溶出過多，從而使總黃酮收率有所降低。另外，考慮到生產成本以及後續工作的工作量，選擇料液比為1:35。
（2）超聲時間對甘草渣總黃酮收率的影響
按照精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，分別超聲10min、20min、30min、40min、50min和60min，在60℃下回流提取2h中方法，固定其他條件，研究超聲時間對甘草渣總黃酮收率的影響。由圖3可知，當超聲時間在10min～40min之間時，甘草渣總黃酮收率隨著超聲時間的延長快速增加，可能是因為超聲作用使細胞破裂，促進總黃酮的溶出，從而提高其收率。當超聲時間達到50min時，總黃酮收率有所下降，可能是因為隨超聲時間的延長，細胞完全破裂，雜質溶出過多，使總黃酮的溶解量減少，也可能是因為超聲時間過長，破壞了總黃酮的結構，從而降低了總黃酮的收率。因而響應麵優化超聲時間條件水平選擇30min、40min和50min。
（3）提取時間對甘草渣總黃酮收率的影響
根據精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲40min，在60℃下分別提取lh、2h、3h和4h實驗方法，固定其他條件，考察提取時間對總黃酮收率的影響，結果見圖4。可以看出，總黃酮收率隨著提取時間的增加呈先增大後平穩的趨勢。當提取時間為2h時，總黃酮收率達到最大。之後再增加提取時間，總黃酮收率幾乎沒有變化。因而響應麵優化提取時間條件水平選擇lh、2h和3h。
（4）提取溫度對甘草渣總黃酮收率的影響
按照精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲40min，分別在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下提取2h試驗方法對提取溫度對甘草渣總黃酮收率的影響進行研究，理論上黃酮類物質易溶於熱水，溫度越高，總黃酮收率應該越高。但研究結果並非如此，如圖5所示，隨著提取溫度的升高，總黃酮收率先增大後降低。當提取溫度達到70℃時，溫度達到最大，之後再增加提取溫度，總黃酮收率反而減小，這可能是由於溫度過高，黃酮類化合物較易分解，或者被氧化，導致其結構遭到破壞的緣故，也可能是因為溫度過高，溶劑揮發劇烈，導致有效溶劑相對減少，從而降低了總黃酮的收率。因而響應麵優化提取溫度條件水平選擇60℃、70℃和80℃。
聲明：本文所用圖片、文字來源《中國食品添加劑》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：自由基，水楊酸，黃酮，乙醇
