γ-氨基丁酸(GABA)是谷氨杆菌一種四碳非蛋白質氨基酸，是酸脱羧酶由穀氨酸脫羧酶不可逆、專一地將L-穀氨酸的枯草α-羧基脫去-分子CO2得到，是芽孢用高度溶於水的兩性離子，pK值為4.03和10.56，表达因此表現出與該類氨基酸類似的谷氨杆菌生理活性，即作為一種抑製性神經遞質存在於哺乳動物的酸脱羧酶中樞神經係統中。目前廣泛應用於工業、枯草動物飼料、芽孢用醫藥和食品行業。表达
大量研究表明，谷氨杆菌GABA有促進睡眠、酸脱羧酶增強記憶力、枯草抗焦慮、芽孢用預防和治療癲癇、表达延緩腦衰老、舒緩血管、調節激素分泌、提高受精率、解除氨毒、增強肝功能等作用。
目前製備GABA的方法主要有植物富集法、化學合成法、微生物發酵法、酶催化法。植物富集法生產GABA雖然安全環保，但GABA濃度低，尚無法用作藥物、食品添加劑；化學合成法生產GABA安全性較差、有化學殘留，也不易達到醫藥及食品行業的標準：微生物發酵法得到的GABA是一個多相複雜體係，濃度低，下遊產物分離成本高，是生產高純度、高濃度GABA的一個瓶頸問題。所以，目前製備GABA多采用酶催化法，主要是利用微生物細胞內分離得到的穀氨酸脫羧酶或能夠生產穀氨酸脫羧酶的微生物細胞專一、不可逆地脫去L-穀氨酸的α-羧基，從而得到高濃度、高純度的GABA。此方法的優點是反應條件溫和、不需要昂貴的原料、能耗低，並且微生物來源的穀氨酸脫羧酶和能夠生產穀氨酸脫羧酶的微生物細胞可通過簡單的細胞培養大量獲取。
目前大多研究以大腸杆菌為宿主表達GAD，催化生產GABA。在重組菌發酵過程中添加一定濃度的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)能夠促進GAD的折疊，從而提高GAD酶活力。除此之外，酶催化法即利用GAD將穀氨酸脫去一分子CO2製備GABA過程中，在酶轉化體係中添加一定量的PLP可以促進酶液或全細胞的轉化舊。有研究者報道了在大腸杆菌發酵過程中直接添加0.02mmol/LPLP後，GABA產量是對照的2.0～2.5倍。但是PLP價格昂貴，在發酵過程和酶轉化體係中直接添加無疑大大增加生產成本。由於大腸杆菌自身具備吡哆醛激酶(PdxK)基因和磷酸吡哆醇氧化酶(PdxH)基因，從而形成PLP補救途徑(見圖1)。輔酶前體吡哆醇(PN)、吡哆胺(PM)和吡哆醛(PL)上57羥甲基通過PdxK使其磷酸化，生成對應的輔酶中問體磷酸吡哆醇(PNP)和磷酸吡哆胺(PMP)以及輔酶磷酸吡哆醛(PLP)，PdxH進一步催化PNP或PMP的氧化反應，生成輔酶PLP，輔酶PLP的增加可促進GAD的折疊，提高GAD酶活力。黃燕等研究了在大腸杆菌發酵過程中添加PN後，酶活是對照組(不添加PN)的1.8倍。
但是大腸杆菌為非食品安全菌株，在發酵過程中易產生內毒素，並且需要添加價格昂貴且有毒害作用的IPTG作為誘導劑誘導產酶，其生產得到的GAD安全性不高，距離滿足食品和醫藥領域的要求還有一定差距。枯草芽孢杆菌是通過美國食品和藥物管理局GARS認證的安全菌株，廣泛應用在食品、醫藥生產中。然而在枯草芽孢杆菌中缺少PdxH，所以無法利用添加輔酶前體PN的方式，通過PLP補救途徑將PN轉化為PLP，從而提高GAD酶活力。目前，大量的研究集中在以枯草芽孢杆菌為宿主生產GAD，在酶轉化過程中通過直接添加輔酶PLP提高轉化效率，如丁偉等運用安全宿主枯草芽孢杆菌生產GABA，在其轉化過程巾直接添加PLP，全細胞催化GABA產量為239.91g/L，轉化率54.48％。由於PLP價格昂貴，導致生產成本較高，無法適應工業化生產需求。關於在枯草芽孢杆菌為宿主生產GAD發酵過程中，添加價格低廉的輔酶前體以提高GAD酶活力的研究未見報道。因此作者以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)為宿主，通過基因工程將大腸杆菌來源的穀氨酸脫羧酶基因(gadB)在B.sMbtilis中異源表達，添加相對廉價的輔酶前體PL，通過PdxK介導的PLP補救途徑將其轉化生成PLP(見圖2)，從而提高酶活和產量，降低生產成本。
質粒EcoliJMl09/pET-24a(+)-gadB為作者所在實驗室前期構建，菌株B.5Mbtilis和表達載體pHY300PLK(含啟動子PHfpaH和ParmyQ，不含信號肽)由作者所在實驗室保存。
LB液體培養基(g/L)：分別稱取氯化鈉10g、酵母粉5g、蛋白腖10g，溶於1L去離子水中，並通過添加2mol/LNaOH或HCl調節pH至7.0。
LB固體瓊脂培養基：LB液體培養基中添加質量濃度為20g/L的瓊脂粉。
高滲液體培養基：LB液體培養基巾添加0.5mol/L山梨醇。
電轉培養基：LB液體培養基中分別添加0.5mol/L山梨醇和甘露醇，質量濃度為100g/L的葡萄糖。
RM培養基：LB液體培養基中添加0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇。
TB培養基(g/L)：分別稱取酵母粉24g、蛋白腖12g、甘油5g、三水磷酸氫二鉀16.43g、磷酸二氫鉀2.31g，溶於1L去離子水中，並添加2mol/LNaOH或HCl調節pH至7.0。
pH至7.0。1.1.3試劑QuickcutHindⅢ限製性內切酶：購自TaKaRa生物醫藥技術有限公司；2xphantaMaxMasterMix、ExnaseⅡ無縫連接試劑盒：購自諾唯讚(南京)生物科技有限公司；DL-10000DNAMarker、氨苄青黴素、四環素：購白寶生物有限公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA同收試劑盒：購白天根生化科技(北京)有限公司
UnstainedProteinMWMarker標準蛋白品、蛋白膠製備試劑盒：購自碧雲天生物技術有限公司：分子級的蛋白腖和酵母粉：購自英國Oxiod公司：其他常規試劑：購自國藥化學試劑有限公司。
PCR儀：購自美國Bio-Rad公司：722型紫外可見分光光度計：購白上海儀電分析儀器有限公司：冷凍式離心機：購自Beckmancoulter公司：KQ-250E型超聲波細胞粉碎機：購自寧波新芝生物科技股份有限公司；pH計：購自瑞士Mettler-Toledo公司：高效液相色譜儀：購自安捷倫科技有限公司。
以質粒pET-24a(+)-gadB為模板，根據無縫克隆同源臂設計原則分別設計正、反向引物：正向弓I物(F1)：57-GGAGTGTCAAGAATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA-3'：反向引物(R1)：5'-‘ITTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTC-3’。
以質粒載體pHY300PLK為模板，根據無縫克隆同源臂設計原則分別設計正、反向引物：
正向引物(F2)：5'-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAATG-3’：反向引物(R2)：5’-GGTGTTTTTTTACCAAGCTT-3’。
將設計好的引物送至蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
以實驗室保存的質粒pET-24a(+)-gadB為模板，F1/R1為正反向引物擴增gadB目的基因；PCR反應體係(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH2034μL、dNTP4μL、模板DNA0.5μL，正、反向引物各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。
PCR程序：94℃預變性5min，98℃變性10S，55℃退火5S。72℃延伸2min，變性至延伸過程進行29個循環：72℃延伸10min；4℃保存。
以質粒載體pHY300PLK為模板，F2/R2為正反向引物擴增表達載體；PCR反應體係(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH2O34μL、dNTP4μL、模板DNA0.5μL,正、反向引物各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。
PCR程序：94℃預變性5min，98℃變性10s，55℃退火5S，72℃延伸6min，變性至延伸過程進行29個循環：72℃延伸10min；4℃保存。
目的基因和表達載體PCR條帶通過瓊脂糖核酸電泳進行驗證。
1.2.2已驗證正確的PCR產物通過瓊脂糖凝膠同收試劑盒進行回收。回收後的PCR產物用ExnaseⅡ連接酶連接，其連接體係如下：ddH2O5.3μL、5×CEBuffer2μL、ExnaseⅡ1μL、表達載體1.16μL、目的基因0.54μL，置於PCR儀37℃反應30min完成連接。
采用大腸杆菌JMl09熱擊轉化法後，將轉化細胞液塗布至含100μg/mL氨苄青黴素的LB固體培養基上，在37℃恒溫培養箱倒置培養10～12h，挑取單菌落至含100μg/mL氨苄青黴素的10mLLB液體培養基中，置於恒溫搖床37℃、200r/min培養8～10h後收集菌體，並提取質粒以便驗證和進行後續實驗。將提取的質粒進行HindⅢ酶切驗證正確後送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將測序正確的質粒通過電擊轉化法導入表達宿主B.Subtilis中，將轉化細胞液塗布至含20μg/mL四環素的LB同體培養基上，在37℃恒溫培養箱倒置培養10～12h，挑取單菌落至含20μg/mL四環素的10mLLB液體培養基中，置於恒溫搖床37℃、200r/min培養8～10h後收集菌體，並提取質粒進行酶切驗證。
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