氨基甲酸乙酯（Ethylcarbamate，短乳对黄的调EC）是杆菌一種在動物乃至人體內具有潛在致癌性的2A類致癌物，存在於多種發酵食品及酒精飲料中，鸟氨如醬油、酸氨奶酪、甲酰基转酒发酵中甲酸葡萄酒、移酶乙酯用黃酒等。氨基研究表明，控作尿素、短乳对黄的调瓜氨酸、杆菌氨甲酰磷酸、鸟氨氰酸和焦碳酸二乙酸是酸氨EC形成的前體物，其中酵母菌和部分乳酸菌通過精氨酸代謝途徑產生的甲酰基转酒发酵中甲酸尿素和瓜氨酸是最重要的2種前體物。
酒類的移酶乙酯用瓜氨酸主要自精氨酸脫亞胺酶途徑代謝產生，在這一途徑中包括3種關鍵酶，氨基分別為精氨酸脫亞胺酶（Argininedeimidase，ADＩ，EC3.5.3.6）、鳥氨酸氨甲酰基轉移酶（Ornithinetranscarbamoylase，OTC，EC2.1.3.3）和氨基甲酸激酶（Carbamatekinase，CK，EC2.7.2.2）。該途徑將精氨酸水解，最終轉化為鳥氨酸、氨和二氧化碳。
目前關於鳥氨酸氨甲酰轉移酶的研究較少，主要集中在人體內，由於是肝髒尿素循環的必需酶，因此OTC酶的缺失常導致嗜睡、嘔吐、精神發育遲緩等症狀，同時OTC的缺失與否也可作為肝細胞癌的早期診斷指標之一。根據之前的研究發現，OTC與氨基甲酸乙酯的形成呈負相關性，即OTC的表達對EC的形成有抑製作用，然而OTC與EC的直接關聯性未見研究報道。
短乳杆菌是一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在含碳水化合物的動物、植物發酵產品以及溫血類動物的消化係統中十分常見，作為一般認為安全（Generallyrecognizedassafe，GRAS）的食品級微生物，在食品、工業、農牧業及醫藥等領域中亦擁有重要的應用價值。挖掘益生性乳酸菌源的酶類是目前人們的關注點之一。
本研究以短乳杆菌中的鳥氨酸氨甲酰基轉移酶為對象，通過基因克隆表達手段和Ni-NTA純化方法，獲得大量高純度的OTC酶，在黃酒發酵的不同階段直接添加到酒體中，研究其與EC之間的相互作用，為挖掘其潛在的工業應用價值奠定基礎。
短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）和質粒pET28a由本實驗室保存，大腸杆菌（Escherichiacoli）BL21（DE3），全試金公司。細菌基因組提取試劑盒、質粒DNA提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Ni-NTA瓊脂糖樹脂、L-精氨酸、L-瓜氨酸、DL-鳥氨酸、茚三酮、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG）、硫酸卡那黴素（Kan），生工生物工程（上海）股份有限公司；T4DNA連接酶、限製性內切酶BamHＩ、SalＩ，TaKaRa公司；麥曲、酒藥，浙江塔牌黃酒公司。
短乳杆菌OTC酶的正向引物序列為：5’-cgcggatccATGACTAAGGATTTTCGGGAAAATGTA-3’（下劃線為BamHＩ識別序列），反向引物序列為：5’-acgcgtcgacTTAAGCTCGTGGAATGAATAAGTTACCT-3’（下劃線為SalＩ識別序列）。以短乳杆菌的基因組DNA為模板進行基因擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證後進行純化。
采用限製性內切酶BamHＩ和SalＩ分別對短乳杆菌OTC基因片段和載體pET-28a進行雙酶切。酶切產物經試劑盒回收後，連接並轉化大腸杆菌BL21（DE3）感受態細胞，塗布在含卡那黴素的LB平板上，經菌落PCR驗證後，篩選得到陽性克隆，並測序鑒定目的基因序列。
挑取陽性單菌落接種於5mL含卡那黴素的LB培養基中，於37℃，200r/min振蕩培養過夜。按1%（體積分數）接種量轉接於200mL的LB培養基中，繼續於37℃，200r/min振蕩培養，至OD600nm達到0.6～0.8時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG），於25℃，180r/min誘導培養過夜。離心收集菌體後，加入30mL緩衝液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/LＩmidazole，pH8.0）重懸菌體，隨後冰水浴超聲破碎細胞，於4℃，12000r/min離心20min，獲得上清液。參照Ni-NTA瓊脂糖樹脂的使用說明方法，采用親和層析純化重組蛋白，隨後利用SDSPAGE檢測蛋白純度及分子質量。
以0.8kg糯米為原料，30℃下浸米2d，高溫蒸煮後冷卻，加入160g麥曲和1.6g酒藥及0.96L水，攪拌均勻後於28℃發酵。以不作任何處理的自然發酵黃酒作為對照組（CK），在發酵第5天加入純化後的鳥氨酸氨甲酰基轉移酶（5D），在發酵第12天加入相同濃度的鳥氨酸氨甲酰基轉移酶（12D），分析比較發酵過程中EC及其相關代謝物的差異。
測定方法參照Fu等[3]的報道，樣品與0.1mL，1.5mol/L鹽酸和0.2mL，0.01mol/L占噸醇正丙醇溶液衍生後，通過高效液相色譜法檢測。以甲醇和水作為流動相，熒光檢測器激發波長233nm，發射波長600nm，梯度洗脫進樣。
尿素和瓜氨酸的檢測方法分別參照陳宜宜等和Boyde等的文獻所述，通過與顯色劑的顯色反應來檢測發酵液中的含量。
取發酵液超聲15min破碎細胞，於4℃，12000r/min離心20min，取上清為原蛋白提取物。根據茚三酮顯色反應來測定OTC酶活，蛋白含量則采用Bradford法進行測定。本試驗中OTC酶活定義為每分鍾水解1mg蛋白質產生1μmol鳥氨酸所需要的酶量為1個酶活單位。
采用日本日立L-8900氨基酸分析儀進行測定。檢測原理為采用茚三酮作為衍生劑與氨基酸衍生後檢測分析。前處理方法為：取50mL黃酒樣品，加0.1mol/L鹽酸溶液超聲振蕩5min，加5%磺酸水楊酸去除蛋白，離心後采用氮吹儀濃縮，加0.02mol/L鹽酸2mL，振蕩後過膜，上機檢測。
將8mL酒樣和0.2gNaCl加入頂空瓶中，50℃下磁力攪拌加熱15min後，將萃取頭插入頂空瓶中，繼續於50℃下加熱30min後進樣。GC色譜條件：載氣為氮氣，流速為1mL/min，無分流進樣；程序升溫：初始柱溫40℃，保持5min，以5℃/mL的速率升溫至230℃，保持10min。進樣口溫度250℃，GC解析時間2.5min。質譜條件：電子轟擊離子源（EＩ）電子能量為70eV，離子源溫度250℃，接口溫度250℃，檢測口電壓為350V。掃描方式為全掃描，質量範圍為35～350。
相對於感官鑒評方法，電子舌實現了酸、苦、澀、鹹、鮮和甜味等基本味及回味的數字化評價，具有結果穩定且受外界影響小的優點。
取適量待測樣品置於電子舌測試杯中，對其酸、甜、苦、澀、鹹、鮮等基本味及回味進行測定，不同味覺與傳感器一一對應，所有傳感器分別在參比溶液和黃酒樣品中浸泡、洗滌，測得電勢值Vr和Vs，通過對Vs-Vr值的計算，即可對黃酒的酸、甜、苦、澀、鹹和鮮味等基本味和回味進行分析。每個樣品重複測試4～5次，為減少係統誤差，選後3次納入數據分析。
每個試驗重複3次，采用SPSS軟件對數值進行差異顯著性分析。
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