酸漿豆腐是传统产酸我國特色的傳統食品，其製作的发酵分离獨特之處在於用酸漿代替傳統的鹽鹵和石膏作為凝固劑。酸漿豆腐一直依靠工人多年經驗進行生產的豆腐小作坊製作方式，先將酸漿老湯加入黃漿水，酸浆其中的中高乳酸菌在常溫下將黃漿水自然發酵為酸漿，再使用酸漿作為酸性凝固劑，乳酸通過點漿使豆漿凝固製成酸漿豆腐。菌的鉴定及特酸漿豆腐口感細膩，性分析風味獨特，传统产酸在我國山東等地已經作為特色食品被列入“非物質文化遺產”。发酵分离然而手工作坊式的豆腐生產方式具有酸漿質量無法保障，生產效率低，酸浆貨架期不穩定等缺點。中高為了實現酸漿豆腐的乳酸工業化生產，促進我國傳統食品的菌的鉴定及特“食文化”廣泛傳播，對酸漿中的乳酸菌進行分離篩選，發掘產酸能力強的菌株井探究其性質，為今後酸漿豆腐的工業化生產打下基礎。
部分學者對豆腐酸漿中的微生物開展了初步探索，喬支紅等利用從豆腐酸漿老湯中篩選到的5株產酸菌發酵大豆黃漿水，以酸漿的pH值為考察指標，探討了單菌發酵、雙菌發酵、發酵溫度、菌種接種量及菌種的混合比例對酸漿pH值的影響，結果表明，酸漿純種發酵的最佳工藝參數為雙菌混合發酵，混合比例1∶9（1號菌∶3號菌），接種量5%，發酵時間24h，發酵溫度42℃；賀雲等從雲南牟定地區的10份自然發酵酸漿豆腐中分離篩選得到6種乳酸菌，並分別鑒定為類布氏乳杆菌、發酵乳杆菌、副幹酪乳杆菌、植物乳杆菌、德式乳杆菌和粘膜乳杆菌，其中植物乳杆菌產酸能力最強；劉倩等從豆清發酵液中分離純化出3株產酸菌，經生理生化和16SrRNA基因序列分析鑒定該菌株為產酸解澱粉乳杆菌。但現有研究局限於單一產地，缺乏對全國酸漿菌種差異的整體研究。
本研究從雲南建水、陝西榆林、山東鄒平、河北淶源、雲南石屏以及北京延慶6個國內具有代表性的酸漿豆腐產地中的7種豆腐酸漿老湯中篩選分離各樣品中的高產酸乳酸菌，通過形態觀察及分子生物學技術進行鑒定，並對其產酸能力、耐酸性、耐鹽性等生長特性進行研究，旨在對全國主要酸漿豆腐產地中的產酸菌構成及特性進行探究，為酸漿中優質乳酸菌生物資源的篩選以及後續酸漿生產工業化奠定基礎、提供科學依據。
豆腐酸漿老湯：雲南建水、陝西榆林、山東鄒平、河北淶源、雲南石屏以及北京延慶的酸漿豆腐加工作坊。
黃漿水培養基：為豆腐壓濾成型後的黃色瀝水，取自北京延慶豆腐廠。MRS肉湯培養基、MRS固體培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。以上培養基在121℃條件下高壓蒸汽滅菌20min。
葡萄糖、無水碳酸鈣、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；二甲基亞碸（色譜純）：北京博奧拓達公司；細菌基因組脫氧核糖核酸提取試劑盒、回收試劑盒、DL3000DNAMarker、TransTaq-TDNAPoly-merase（250U）、10×TransTaq-TBuffer、2.5mmol／L脫氧核糖核苷三磷酸、6×DNALoadingBuffer：美國TransTaq公司。
YP20001電子大平：上海雷韻實驗儀器製造有限公司；PHS-3CpH計：匕海精密科學儀器有限公司；DL-CJ-2ND型超淨工作台：北京東聯哈爾儀器製造有限公司；YQX-SG46-280S自動高壓滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TENSUC恒溫培養箱：匕海大呈實驗儀器製造有限公司；TU-1900紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-16aR高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；1260series高效液相色譜儀：美國Agilent科技有限公司；T1000聚合酶鏈式反應儀：美國Bio-Rad公司。
酸漿的活化與增殖培養采用喬支紅等的方法。取5mL酸漿接種於20mL黃漿水培養基中，在37℃恒溫培養箱中靜置培養48h。
將增殖培養的酸漿經無菌生理鹽水梯度稀釋至10-4、10-5、10-6三個梯度，取100μL梯度稀釋液於空白培養皿中，倒入融化井冷卻至45℃左右的含有2%CaCO3的MRS肉湯培養基，於37℃恒溫培養箱中倒置培養48h。挑取產生溶鈣圈的菌落於MRS固體培養基反複劃線分離直至出現單菌落，鏡檢後選取符合乳酸菌形態、無雜菌的菌落接種於MRS斜麵培養基於4℃保存。
將每個樣品中分離純化得到的乳酸菌活化後接種於MRS肉湯培養基中，37℃恒溫靜置培養24h，測定培養基pH值，選取每個樣品中pH值最低的菌株為該樣品中高產酸菌株。
采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板對菌株的16SrDNA進行PCR擴增。PCR擴增引物為16SrDNA通用引物1492R、27F；PCR擴增體係：10×buffer5μL，10×TransTaq-T0.5μL，引物27F1μL，引物1492R1μL，DNA模板1μL，dNTPs4μL。PCR擴增程序：預變性10min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，29個循環；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。將PCR擴增產物用回收試劑盒回收，使用測序儀對PCR擴增產物進行測序。
將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心的Genbank數據庫中進行基本局部比對搜索工具比對，選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA序列，采用MEGA-X10.1軟件中的鄰接法構建係統發育樹。
將活化後的菌種按2%（V／V）的接種量接種於MRS肉湯培養基中，37℃恒溫靜置培養。取樣時間間隔為前12h每隔2h取樣測定；12h後每隔4h取樣測定；24h後每隔12h取樣測定。發酵液經蒸餾水稀釋10倍後，滴加5滴酚酞溶液，用0.1mol／L氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色出現，且30s後不褪色即為滴定終點，記錄NaOH消耗體積，三組平行。以滅菌後的MRS肉湯培養基作為空白對照，計算產酸量，其計算公式如下：
X=（V1-V2）×CNaOH×0.09×100／V樣品X為樣品產酸量（以乳酸計），g／100mL；V1為樣品消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；V2為空白培養基消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；CNaOH為標定的氫氧化鈉濃度，g／L；0.09為乳酸的換算係數。
將活化後的菌種接種於MRS肉湯培養基中，37℃恒溫靜置培養12h。采用高效液相色譜（HPLC）進行有機酸組成分析。液相色譜條件：色譜柱為CarbomixH-NP10：8%（10μm，7.8×300mm）；流動相為20mmol／LNaH2PO4；進樣體積為10μL；流速為1.0mL／min；柱溫為30℃；檢測波長為210nm。
以自然pH值的MRS肉湯培養基（pH6.83）作為空白對照，將預先活化好的菌株按2%（V／V）的接種量分別接種於pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的培養基中，37℃靜置培養48h，采用分光光度計在波長600nm處測定其OD600nm值。
將預先活化好的菌株按2%（V／V）的接種量接種於鹽濃度分別為0、1%、2%、3%、4%、5%的MRS肉湯培養基中，37℃靜置培養48h，測定其OD600nm值。
利用Excel與SPSS18.0軟件對數據進行分析處理，使用MEGA-X10.1軟件構建係統發育樹。
聲明：本文所用圖片、文字來源《中國食品添加劑》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：豆腐，鄰苯二甲酸氫鉀，二甲基亞碸，脫氧核糖核酸
