板栗屬殼鬥科栗屬堅果類植物，板栗在世界範圍內被作為重要的壳原農作物之一。板栗深加工過程中產生大量的花青化板栗殼仍以燃燒和自然腐爛等方式處理，這樣既造成了資源浪費也不利於環保。素稳據資料顯示，定性板栗殼中含有色素、结构及体有機酸、分析多酚類、外消多糖(或苷類)和鞣質等化學成分。板栗板栗殼的壳原多酚類物質主要組分為單寧，而單寧的花青化種類包括很多，其中具有抗氧化活性結構的素稳主要成分為鞣花單寧和原花青素。人體內的定性自由基過剩會引起多種疾病，包括心血管疾病、结构及体白內障、分析阿爾茨海默氏症等，但是體內的內源性抗氧化物質不足以防禦細胞損傷，所以從食物資源中尋找天然抗氧化劑已成為研究熱點。有研究表明板栗殼原花青素具有抵禦自由基、抑菌殺菌等作用，可以廣泛應用於食品及調味品行業。丁培峰研究了茶多酚在醬油中的防腐效果，結果顯示，茶多酚與納他黴素複配使用後與山梨酸鉀具有等同的防腐效果，且安全性大大提升。同時，茶多酚具有一定的保健功效，可提高醬油的營養價值和保健功能。
多酚類物質雖然具有多種生理活性和延長調味品保質期的效果，但是外界條件也會影響其穩定性，從而降低它的生理活性，且人體中的胃液及腸道消化液也會對多酚的活性產生影響。例如，提取自薑黃根莖的多酚類化合物薑黃素的藥理作用廣泛，毒性小，並且長期以來作為調味品和食品添加劑在國內外廣泛應用，但是，由於其生物利用度低顯著影響其應用價值。目前對板栗殼原花青素的研究主要在抗氧化性及提取優化等方麵，對其作為調味品功能性添加劑的開發以及其在人體中的消化吸收研究較少。因此，本實驗探究影響板栗殼粗提物中原花青素穩定性的因素，利用HPLC-MS研究其種類並進行結構表征，同時通過人體體外消化模型研究其消化情況，為板栗殼中天然抗氧化劑的開發及其在食品和調味品方麵的應用提供一定的參考依據。
一、材料與方法
1、材料與試劑
板栗：取自山東祁蒙山。
香草醛、α-澱粉酶、膽汁提取物、胰蛋白酶、胃蛋白酶：國藥集團化學試劑有限公司；標準品表兒茶素、沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
2、儀器與設備
TG16-WS離心機長沙湘智離心機儀器有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計上海美諾達儀器有限公司；pH計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Agilent1100LC-MSD/TOF高分辨液相質譜聯用儀美國安捷倫科技公司。
3、試驗方法
（1）板栗殼粗提物提取製備
將板栗殼洗淨晾幹，粉碎過40目篩得到板栗殼粉末。參考蘇雲霞等研究得到的最佳提取工藝，取適量板栗殼粉末加入70%乙醇水溶液，使料液比為1∶15(g/mL)，在65℃的條件下提取90min，再將提取液進行真空抽濾，濾液在40℃下真空濃縮，再次冷凍幹燥，低溫保存備用。
（2）板栗殼粗提物中原花青素穩定性影響因素研究
①板栗殼原花青素溶液的製備
稱取板栗殼粗提物0.1g，用蒸餾水定容至100mL，研究光照、溫度、金屬離子和pH對原花青素的影響。
②光照對板栗殼原花青素的影響
取10mL板栗殼原花青素溶液3份，分別置於室溫光照、室溫避光和低溫避光的條件下，放置4d，每隔1d取樣測定樣品溶液中原花青素含量(以保存率表示)；原花青素保存率=樣品待測時原花青素含量/樣品初始原花青素含量×100%。原花青素的測定方法采用硫酸-香草醛比色法。
③溫度對板栗殼原花青素的影響
取10mL板栗殼原花青素溶液6份，分別在40，50，60，70，80，90℃條件下恒溫水浴2h，原花青素含量測定方法同上。
④pH對板栗殼原花青素的影響
取10mL板栗殼原花青素溶液14份，用HCl和NaOH溶液配製成pH為1～14的溶液，將原花青素樣品與10mLpH為1～14的溶液混合，密封靜置6h，原花青素含量測定方法同上。
⑤金屬離子對板栗殼原花青素的影響
配製0.02mol/L含Fe3+、Fe2+、Ba2+等金屬離子的溶液待用，再把不同金屬離子溶液與原花青素溶液等體積混合，密封放置一段時間，觀察溶液顏色變化。
（3）板栗殼原花青素結構分析
用高效液相測定沒食子酸、沒食子兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯6種標準品及板栗殼粗提物出峰時間，比較得出板栗殼粗提物中所含物質，並對粗提物進行高分辨質譜結構分析。
色譜條件：色譜柱為DIONEXC18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相：甲醇(B)(體積分數為0.05%)-三氟乙酸(A)，梯度洗脫：0～12min，A：87%～75%，B：13%～20%；12～23min，A：75%～20%，B：25%～80%；23～26min，A：87%，B：13%。流速：0.5mL/min；檢測波長：280nm；柱溫：35℃；進樣量：20μL。
質譜分析條件：色譜柱為LichrosphersC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；質譜進樣分流比為1∶1；負離子模式；離子化方式：ESI；掃描範圍：m/z50～2000；幹燥氣溫度：350℃；幹燥氣流速：15L/min；噴霧壓力：40psi；毛細管電壓：3500V。
（4）板栗殼原花青素的消化吸收
①消化體係的製備
胃液環境配製：在250mL燒杯中加入0.4g的胃蛋白酶、9mg/mL的氯化鈉溶液90mL混勻，再轉入100mL的容量瓶中，用1mol/L鹽酸調節使溶液pH為2～2.3，直至溶液至容量瓶刻度線。
腸道環境配製：在250mL燒杯中加入225mg的胰蛋白酶、225mg的膽汁提取物、9mg/mL的氯化鈉溶液90mL混勻，再轉入100mL的容量瓶中，用1mol/L氫氧化鈉調節使溶液pH為7～7.2，直至溶液至容量瓶刻度線。
②模擬胃液消化
設置5組平行試驗和1個空白對照，每組平行實驗條件如下：在50mL錐形瓶中依次加入中口腔消化液4mL、胃消化液16mL，於37℃、轉速為250r/min的搖床中震蕩反應2h，每0.5h測1次pH值，通過測pH的變化可初步判斷原花青素是否消化；並在反應時間為0.5，1，1.5，2h各取1mL消化液，測定原花青素的含量，並計算其消化率；消化率=(1-測得原花青素質量/最開始加入原花青素質量)×100%。
③模擬腸道消化
設置5組平行試驗和1個空白對照，每組平行實驗條件如下：量取胃液消化液20mL，用氫氧化鈉中和到pH為7，終止胃液消化反應；再加入20mL腸道消化液反應2h，並在反應時間0.5，1，1.5，2h各取1mL消化液測定原花青素的含量，並計算其消化率。
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