建立了高效液相色譜法快速準確定量微量植物體中重要植物色素（葉綠素a、高效葉綠素b和葉黃素）的液相分析方法。微量植物葉片以95%乙醇勻漿超聲提取色素4 h，色谱素過濾膜後直接分析。法准色譜分離選用COSMOSIL氰基柱（4.6 mm × 250 mm，确定5 μm），量微量植以甲醇-水洗脫進行洗脫，物体物色流速為1.0 mL/min，中的重植用二極管陣列檢測器檢測，高效可在15 min內完全植物中三種重要色素的液相快速分離分析。結果表明，色谱素三種色素在0.05～50 mg/L範圍內線性關係良好（相關係數均為0.9999）；平均加標回收率為90%～110%；相對標準偏差（RSD）＜5%；日內及日間精密度均＜5%，法准滿足定量要求。确定與目前檢測植物色素的量微量植方法相比，該方法前處理簡單快速，物体物色且采用簡單的甲醇-水體係快速分離植物色素，結果可靠，重現性好，可為植物體的生理研究提供基礎。
植物色素是植物體內能夠吸收太陽光，並在光合作用時將光能轉化為化學能的關鍵物質，同時植物的色澤和氣味也受其色素的影響。在綠色植物中，葉綠素是其中最豐富的色素，經研究，通常情況下植物的光合速率隨葉綠素含量的升高而增強，同時產量的高低基本依賴於光合速率的快慢。因而，葉綠素含量被普遍當作是一個能夠準確評價植物的光合作用與產量產出的可靠指。葉綠素，分為葉綠素a和葉綠素b，其不溶於水，可溶於有機溶劑，屬於脂溶性色素。顏色上，葉綠素a呈現藍綠色，而葉綠素b呈現黃綠色；功能上，研究表明，葉綠素可有效地降低膽固醇、促進傷口愈合、解毒、抗癌等。除葉綠素外，葉黃素也廣泛存在於各種植物以及蔬菜水果中，據相關研究，葉黃素不僅可以過濾藍光、保護視網膜還能夠抗氧化 。另外，一些惡劣的環境因素如低溫、空氣汙染、營養缺乏、幹旱等都會影響植物色素的含量與組成，進而影響植物的光合速率、香味和顏色。因此葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉黃素含量的準確測定對研究植物的光合生理與植物特性都具有重要意義。

目前，測定植物色素的常用方法紫外分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法等。高效液相-質譜聯用技術有著高壓、高速、以及高靈敏度的優點。該方法經液相色譜分離，比現有的紫外分光光度法具有更低的幹擾及檢出限；與熒光分析法相比，二極管陣列檢測器更為普及。利用液相色譜定量檢測植物色素含量準確率高。這3種色素結構相似、性質相近，有必要發展一種能夠很好地分離3種色素且能準確定量的色譜方法。選擇能獲得對稱峰形的色譜柱、合適的流動相以及合適的流動相比例對於植物體中葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素的色譜分離分析十分重要。

本文使用鍵合氰基的氰基色譜柱，以簡單的甲醇和超純水為流動相，建立一種快速定量分析植物體中葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素含量的反相高效液相色譜法，極大地提高了植物體中該3種重要色素含量準確測定的可靠性和速度，為研究植物體的生理特性提供了基礎。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Shimadzu LCMS-2020型液相色譜-質譜聯用儀（日本島津公司）；COSMOSIL型氰基柱（日本半井公司）；FLUKO F6/10-8G型超細勻漿機（上海弗魯克流體機械製造有限公司）；Heraeus型高速低溫離心機（韓國賀利氏公司）；百萬分之一、十萬分之一OHAUS型電子分析天平（美國奧豪斯公司）；Millipore Simplicity型超純水係統（美國Merck公司）。

無水乙醇、0.45 μm過濾頭、新鮮綠色植物葉片、甲醇（德國CNW公司）、葉綠素a標準品（99.9%）、葉綠素b標準品（99.9%）、葉黃素標準品（99.9%）（美國CIL公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配製

標準儲備溶液：利用百萬分之一天平準確稱取0.5 mg葉綠素a標準品、葉綠素b標準品、葉黃素標準品，分別用95%乙醇溶解，於25 mL容量瓶中定容，儲存於-20 ℃冰箱，備用。

混合標準儲備溶液：各取5 mL上述葉綠素a和葉綠素b的標準儲備溶液混合，儲存於-20 ℃冰箱，備用。

標準溶液的配製：用上述的混合葉綠素a和葉綠素b的標準儲備溶液以及葉黃素分別逐級稀釋，配製成濃度為0.05、0.5、2.0、10、50 mg/L的係列標準工作溶液。

1.2.2 植物樣品的前處理

精密稱取0.1 g的綠葉碎片以及綠葉根部各3份，分別加入1 mL 95%乙醇溶液，勻漿，勻漿後放置於冰箱中低溫提取4 h，提取完畢後於4 ℃下高速離心20 min。低溫離心後取上層綠色清液，過0.45 μm微孔濾膜後，置於2 mL液相小瓶中備用。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：氰基柱（4.6 mm × 250 mm，粒徑5 μm），流動相：V（甲醇（A））：V（純水（B））=76:24；流速為1 mL/min，二極管陣列檢測器（PDA）波長為663 nm（葉綠素a）、645 nm（葉綠素b）、445 nm（葉黃素）；柱溫箱溫度40 ℃；進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

2.1.1 流動相的選擇

目前，反相高效液相色譜檢測植物色素的流動相複雜且分離效果差，難以達到準確定量的目的。本研究旨在采用常規流動相水，甲醇，乙腈或其中的兩種到3種混合溶劑對植物中的色素進行分析。由於植物色素葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素極性較小（下圖為3種色素的化學結構），所以采用有機溶劑作為洗脫劑。此外，葉綠素a和葉綠素b結構相似，乙腈洗脫能力較甲醇強，若用乙腈作為洗脫液，兩種色素難以分離，導致影響色素的準確定量，因此選用甲醇作為洗脫劑。用甲醇和純水作流動相，實驗中不斷改變流動相的比例：V（甲醇）：V（水）為95:5、90:10、80:20、70:30。當流動相的V（甲醇）：V（水）=70:30時，葉綠素a、葉綠素b和葉黃素的峰形較好，分離度符合要求，在20 min之內出峰。為了進一步縮短出峰時間，優化峰形，進一步優化洗脫流動相比例[17]，使得3種植物色素的出峰時間控製在15 min以內，最終選用V（甲醇）：V（水）=76:34為流動相進行綠色植物中葉綠素a、葉綠素b和葉黃素的分離。

被分析物的洗脫速率影響因素之一為流動相的流速[17]，流速的不同影響著物質在色譜中的出峰時間，在不幹擾分離效果的條件下，同時節約時間成本，應盡量提高流動相的流速。綜合各種因素，流速以1.0 mL/min為適中。

檢測波長的選定是紫外及熒光類的檢測器的關鍵。本研究采用的紫外檢測器是全程掃描、二極管陣列的三維檢測器，經過多次的嚐試，確定葉綠素a的激發波長為663 nm；葉綠素b的激發波長為645 nm；葉黃素的激發波長為445 nm。

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