水產品口感鮮美、水产營養豐富，品腐深受消費者的败希白喜愛，然而，瓦氏水產品極易腐敗變質，菌冷激蛋结构造成巨大的分析經濟損失。由於微生物的水产生長和入侵是導致水產品腐敗的主要因素，因此水產品的品腐保鮮過程中對微生物的抑製十分重要。低溫保鮮技術是败希白使用最早，也是瓦氏應用最廣的水產品保鮮技術。低溫會使微生物的菌冷激蛋结构生理機能發生重要的變化，比如膜流動性降低，分析核酸二級結構穩定性增強，水产轉錄、品腐翻譯及蛋白折疊的败希白效率降低等。在低溫下有些微生物仍能以一定的生長速率生長，即使生長較慢。腐敗希瓦氏菌是一種耐冷菌，在0℃下也能生長、繁殖，其在有氧冷凍或冷藏狀態下是多種水產品的特定腐敗菌，引起冷藏水產品的腐敗變質，這嚴重降低了水產品的品質，極有可能導致食品安全問題。鑒於水產品保鮮的重要經濟價值，深入了解腐敗希瓦氏菌低溫適應的分子機製，可以輔助預測腐敗菌在冷藏食品中的行為，便於進行更準確的風險預測和防範。
研究發現，微生物在低溫作用下會產生冷應激反應，生成一係列的抗低溫蛋白，稱為冷激蛋白。細菌冷激蛋白是一類包含核酸結合冷休克結構域的高度保守的小分子蛋白（～7.4ku），可以作為分子伴侶與單鏈DNA或單鏈RNA結合，阻止DNA或RNA在低溫下形成二級結構，從而促進轉錄和翻譯。此外，冷激蛋白還參與細菌的多個生理生化過程，如：細胞膜的流動性，細菌正常生長與分化，營養脅迫，細菌的毒力等。冷激蛋白對細菌在低溫時恢複生長和發揮細胞各種功能是非常重要的，是解析微生物低溫適應機製的關鍵蛋白。然而，目前關於腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的研究鮮有報道。
細菌通常具有多個冷激蛋白，且冷激蛋白的作用規律十分複雜，並非所有冷激蛋白都受低溫誘導表達。通過對NCBＩ數據庫中腐敗希瓦氏菌模式菌株的全基因組序列檢索，發現腐敗希瓦氏菌中存在3個典型冷激蛋白，目前尚未發現有關其主要冷激蛋白及相關功能的研究。本文以水產品的腐敗希瓦氏菌為研究對象，通過PCR擴增獲得水產品腐敗希瓦氏菌的3個冷激蛋白基因序列，在此基礎上通過生物信息學分析腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的理化性質、結構和功能特性等，旨在為冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應過程中的功能研究，以及對水產品中腐敗希瓦氏菌的抑製提供參考。
腐敗希瓦氏菌為本實驗室自腐敗的冷藏大菱鮃中分離所得，於-80℃保藏。聚合酶鏈式反應（Polemerasechainreaction，PCR）引物委托生工生物工程（上海）技術服務有限公司合成
EasyTaqRDNAPolymerase，北京全是金生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、GeneRed核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司；Biowest瓊脂糖、LB營養瓊脂、LB營養肉湯，青島高科園海博生物技術有限公司。
防蒸發梯度PCR，美國Eppendrof公司；凝膠電泳及配套設備，美國Bio-Bad公司；微量冷凍離心機，美國Thermo公司。
活化本實驗室保藏的腐敗希瓦氏菌，按照基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取基因組DNA，利用細菌16SrRNA基因通用引物27F和1492R進行PCR擴增，獲得腐敗希瓦氏菌的16SrRNA基因（表1）。采用NCBＩ檢索近緣腐敗希瓦氏菌菌株基因組信息（GenBank：CP002457.1），依據注釋冷激蛋白基因及其上、下遊序列，設計引物（表1），進行冷激蛋白的Csp1589，Csp1376和Csp2252基因的擴增。PCR擴增條件為94℃5min；94℃30s，Tm℃30s（詳見表1），72℃45s，循環30次。PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測後送至上海生工測序。
自NCBＩ數據庫獲得大腸杆菌（NC_000913.3）的9個冷激蛋白（CspA～Ｉ），以FASTAfile形式保存。通過軟件ClustalX對測序所得腐敗希瓦氏菌冷激蛋白和大腸杆菌的冷激蛋白進行序列比對，並用Mega7.0中的鄰接法（Neighbor-jioningmethod，NＪ）為其構建係統發生樹，步長值（Bootstrapvalues）為1000。
ExPASy網站中的一個工具ProtParam來預測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，用PSORTwwwServer中的PSORTPrediction工具預測冷激蛋白細胞定位，用TMHMMServer2.0預測冷激蛋白跨膜區域，用SignalＩP5.0在線預測冷激蛋白信號肽，用SMART預測冷激蛋白結構域的構成及其功能，用在線軟件NCBＩConservedDomainSearch進行其氨基酸保守序列分析。
使用PSＩPRED預測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的二級結構。將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到SWＩSS-MODEL網站進行三級結構的預測。將構建的蛋白三級模型用PROCHECK和Ｖerify3D進行質量評估。PROCHECK和Ｖerify3D是SAＶESv5.0中的結構評估服務。
用STRＩNG工具確定在活體內與腐敗希瓦氏菌冷激蛋白存在相互作用的蛋白。這種相互作用既包括蛋白質之間直接的物理相互作用，也包括蛋白質之間間接的功能相關性。將從SWＩSS-MODEL得到的模型文件輸入COACH，以預測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白潛在的配體結合位點。
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