一、果蔬杆菌目的病性要求
1、掌握微生物檢驗的大肠的测定一般方法。
2、果蔬杆菌學會果蔬中致病性大腸杆菌的病性測定方法。
二、大肠的测定實驗原理
根據大腸杆菌在一定條件下能發酵乳糖、果蔬杆菌產酸產氣，病性以及生化指標和血清學特征做出綜合判斷。大肠的测定
三、果蔬杆菌實驗試劑與儀器
1．培養基和試劑
①乳糖膽鹽發酵管：將20g蛋白腖、病性5g豬膽鹽(或牛、大肠的测定羊膽鹽)及10g乳糖溶於水中，果蔬杆菌校正pH至7.4，病性加入指示劑，大肠的测定分裝每管10mL，並放入一個小倒管，115℃高壓滅菌15min。
②營養肉湯：將10g蛋白腖、3g牛乳膏及5g氯化鈉溶於1000mL蒸餾水中，校正pH至7.4，分裝燒瓶，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。
③腸道菌增菌肉湯：將10g蛋白腖、5g葡萄糖、20g牛膽鹽、8g磷酸氫二鈉、2g磷酸二氫鉀、0.015g煌綠溶於少量熱水中，然後稀釋至1000mL蒸餾水中，校正pH至7.2。分裝每瓶30mL，1150C高壓滅菌鍋15min。
④麥康凱瓊脂：將17g蛋白腖、3g脈腖、5g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)及5g氯化鈉溶解於400mL蒸餾水中。校正pH至7.2。將17g瓊脂加入600mL蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合並，分裝於燒杯內，1210C高壓滅菌15min，備用。臨用時加熱溶化瓊脂，趁熱加入10g乳糖，冷至50～55℃時加入10mL 0.01％結晶紫和5mL0.5％中性紅水溶液，搖勻後傾注平板。
⑤伊紅美藍瓊脂(EMS)：將10g蛋白腖、2g磷酸氫二鉀和17g瓊脂溶解於1000mL蒸餾水中，校正pH至7.1，分裝於燒瓶內，121℃高壓滅菌15min備用。臨用時加入10g乳糖並加熱溶化瓊脂，冷至50～55℃，加入伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。
⑥三糖鐵瓊脂(TSI)：將20g蛋白腖、5g牛肉膏、10g乳糖、10g蔗糖、lg葡糖糖、5g氯化鈉、0.2g硫酸亞鐵銨及0.2g硫代硫酸鈉溶於1000mL蒸餾水中，校正pH至7.4。加入12g瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂。加入0.025g 0.2％酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高檔的底層。121℃高壓滅菌15min，放置高層斜麵備用。
⑦克氏雙糖鐵瓊脂(KI)：取兩份500mL血消化湯(pH=7.6)，分別加入6.5g，2g瓊脂，加熱溶解。第一份作為上層培養基，第二份作為下層培養基。在上層培養基中加入0.1g硫代硫酸鈉、O.1g硫酸亞鐵銨、5g乳糖及5mL0.2％酚紅溶液，分裝於燒瓶內；在下層培養基中加入1g葡萄糖及5mL0.2％酚紅溶液，分裝於12mm×100mm滅菌試管內，每管約2mL，115℃高樂滅菌10min。將上層培養基放在56％：水浴箱內保溫；將下層培養基直立放在室溫內，使其凝同。待下層培養基凝固後，以無菌手續將上層培養基分裝於下層培養基的上麵，每管約1.5mL，放成斜麵。
⑧糖發酵管：將10g蛋白腖、5g牛肉膏、3g氯化鈉、2g磷酸氫二鈉及12mL0.2％溴麝香草酚藍溶液溶於1000mL蒸餾水中，校正pH至7.4。按0.5％加入所需糖類(如乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)，分裝於有一個倒置小管的小試管內，12l0C高壓滅菌15min。
⑨賴氨酸脫酸酶試驗培養基：將5g蛋白腖、3g酵母浸膏、1g葡萄糖及1mLl.6％溴甲酚紫-乙醇溶液溶於少量熱水，然後稀釋至1000mL蒸餾水中，分裝每瓶100mL，分別加入各種所需氨基酸。再行校正pH至6.8。對照培養基不加氨基酸。分裝於滅菌的小試管內，每管0.5mL，上麵滴加上一層液體石蠟，115℃高壓滅菌10min。
⑩尿素瓊脂：將1g蛋白腖、5g氯化鈉、1g葡萄糖、2g磷酸二氫鉀及3mL0.4％酚紅溶液溶於1000mL蒸餾水中，並校正pH至7.2±0.1，加入20g瓊脂，加熱溶化並分裝燒瓶。121℃高壓滅菌15min。冷至50～55℃，加入經除菌過濾的100mL 20％尿素溶液。尿素的最終濃度為2％，最終pH應為7.2±0.1。分裝於滅菌試管內，放成斜麵備用。
2、儀器
采樣箱；滅菌攪拌棒；滅菌勺子、鑷子等；滅菌具塞廣口瓶；滅菌塑料袋；酒精燈；冰箱；恒溫培養箱；恒溫水浴鍋；顯微鏡；離心機；酶標儀；均質器(或滅菌乳缽)；架盤藥物天平；細菌濃度比濁管；滅菌廣口瓶；滅菌錐形瓶；滅菌吸管；滅菌培養皿；滅菌試管；注射器；滅菌刀、剪、鑷子等；小白鼠；硝酸纖維素濾膜(150mm×50mm，0.45μm)，滅菌備用。
四、實驗步驟
1、增菌
樣品采集後應盡快檢驗，除易腐食品在檢驗之前應預冷藏外，一般不冷藏。以無菌手續稱取檢樣25g，加在225mL營養肉湯中，以均質器打碎1min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養基，以測定大腸菌群MPN值，其餘的移入500mL廣口瓶內，於(36±1)℃培養6h，取出一接種環，接種於一管30mL腸道菌增菌肉湯內，於420C培養18h。
2、分離
將乳糖發酵陽性的乳糖膽鹽發酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍瓊脂平板。
汙染嚴重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種伊紅美藍瓊脂平板，於(36±1)℃培養18-24h，觀察菌落。不但要注意乳糖發酵的菌落，同時也要注意不發酵和遲緩發酵的菌落。
3、生化試驗
①自鑒別平板上直接挑取數個菌落分別接種於三糖鐵瓊脂或克氏雙糖鐵瓊脂上，同時將這些培養物分別接種於蛋白腖水、半固體瓊脂、pH=7.2的尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養基。以上培養物均在360C培養過夜。
②TSI斜麵產酸或不產酸、底層產酸，H2S陰性、KCN陰性和尿素陰性的培養物為大腸埃希菌。
TSI底層不產酸，或H2S、KCN和尿素等試驗中有任一項為陽性培養物，均非大腸埃希菌。
必要時可做氧化酶試驗和革蘭染色。
4、血清學試驗
①挑取經生化試驗證實為大腸埃希菌的瓊脂培養物，用致病性大腸埃希菌、侵襲性大腸埃希菌和產腸毒大腸埃希菌多價0血清和出血性大腸埃希菌0157血做玻片凝集試驗。當與某一種多價血清凝集時，再與該多價血清所包含的單價O血清做試驗。如與某一單價0血清呈現強凝集反應，即為假定試驗陽性。
致瀉性大腸埃希菌所包括的0抗原群有EPEC、EHEC(如0157)、EIEC和ETEC諸類群，參見有關致瀉性大腸埃希菌的0抗原菌群。
②證實試驗：製備0抗原懸液，稀釋至與MacFarland 3號比濁管相當濃度。原效價為1:600～1:320的0血清，用0.5％鹽水稀釋至1:40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm的管內等量混合，做單凝集試驗。混勻後放入500C水浴箱內，經16h後觀察結果。如出現凝集，可證實為該0抗原。
五、結果報告
綜合生化試驗、血清學試驗作出報告。
六、注意事項
細菌的分裂是無規律的，因此為了獲得足夠的統計準確度，要求進行5管平行試驗。
參考資料：食品中有毒有害物質檢測
相關鏈接：大腸杆菌，乳糖膽鹽發酵管，麥康凱瓊脂，伊紅美藍瓊脂
