1.4法蘭克福香腸人工汙染單核細胞增生李斯特菌

取同批號待檢法蘭克福香腸6～7袋，单核搓揉外包裝，细胞性单使內容物與液體充分接觸。增生珠的制备無菌開啟包裝，李斯链抗取浸出液40mL（每袋約6mL），特菌特异体磁混勻，单核作為待測樣，细胞性单置4℃保存。增生珠的制备人工汙染前，李斯链抗取1mL浸出液通過增菌培養法檢測待測樣。特菌特异体磁選擇未受李斯特菌屬汙染的单核待測樣，接種新鮮培養的细胞性单單核細胞增生李斯特菌（AＴCC19115），使其終濃度約為＜1CFU/mL、增生珠的制备1CFU/mL、李斯链抗10CFU/mL和100CFU/mL。特菌特异体磁汙染後將樣品置4℃穩定24h，模擬食用前的微生物存活狀態。

1.5法蘭克福香腸人工汙染單核細胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌

取40mL待測樣，分別接種新鮮培養的單核細胞增生李斯特菌AＴCC19115（LM）和英諾克李斯特菌AＴCC51742（LI）。菌液終濃度LM/LI的比例分別為1/1，1/10，1/100，1/1000，10/10，10/100，10/1000，100/10，100/100和100/1000。汙染後將樣品置4℃穩定24h。

1.6目標菌的磁珠捕獲與菌落計數

1.6.1 BHI培養基中磁珠的捕獲效率

分別將3株單核細胞增生李斯特菌和6株其它李斯特菌屬細菌接種至BHI培養基中培養（表3），製成約105CFU/mL菌液。取上述菌液1mL，分別加入20μL免疫磁珠溶液，4℃輕微振蕩1h。用PBS緩衝液在磁力架上清洗3次，用1mL相同的緩衝液重懸，必要時進行10倍係列稀釋。以6×6滴板計數法（每滴10μL）在BHI瓊脂培養基上計數，比較磁珠捕獲前後微生物的數量變化。

1.6.2法蘭克福香腸中單核細胞增生李斯特菌的檢測

以USDA-FSIS檢測方法為基礎（MicrobiologyLaboratoryGuidebook，MLG8.1），結合磁珠捕獲和PCR確認技術，檢測法蘭克福香腸中的單核細胞增生李斯特菌。取第1次增菌的UＶM培養基（Modifieduniversityofvermontbroth）90mL，加入10mL人工汙染浸出液，置（30±2）℃振蕩160r/min培養（22±2）h。分別取0.1mLUＶM培養物至第2次增菌的10mLFB培養基（Fraserbroth）和10mLMOPS-BLEB培養基（Morpholinepropanesulfonicacidbufferedlisteriaenrichmentbroth）中，置（35±2）℃振蕩250r/min培養（26±2）h。取上述UＶM、FB和MOPS-BLEB培養物各1mL，分別加入scFv-IMBs和Dyna-IMBs溶液20μL，按1.6.1節的方法分別在BHI瓊脂和顯色瓊脂上計數。剩餘的磁珠捕獲液用於顯色培養基劃線和細菌基因組DNA提取。

2結果

2.1BHl培養基中磁珠的捕獲效率

采用9株細菌考察BHI培養基中兩種磁珠的特異性。scFv-IMBs對3株單核細胞增生李斯特菌的捕獲率在15%～55%之間，高於同種培養基中Dyna-IMBs的0.85%～1.27%捕獲率。scFvIMBs除對斯氏李斯特菌和伊氏李斯特菌的捕獲率略高於Dyna-IMBs外，對李斯特菌屬中非單核細胞增生李斯特菌的捕獲率均低於0.61%。在BHI純培養係統中，scFv-IMBs顯示出良好的特異性和較高的捕獲率。

2.2備選PCR引物的驗證

為了從5種備選的引物中選擇出單核細胞增生李斯特菌特異性PCR檢測引物，針對23株待測微生物進行PCR引物驗證。引物Lmo0733具有李斯特菌屬水平特異性；格式李斯特菌幹擾引物Aznar的檢測；威爾斯李斯特菌、格式李斯特菌和部分英諾克李斯特菌幹擾引物Ｊaton的檢測。經試驗確認的單核細胞增生李斯特菌種水平的特異性為引物Fluit和Nied（表1），這兩對引物目標靶點是對李斯特菌溶血素O基因（hlyA）。由於引物Nied在51℃退火時具有較高的檢測靈敏度，可檢測到約2.86pg的單核細胞增生李斯特菌基因組（數據未列出），被用於後續試驗的PCR檢測中。

2.3法蘭克福香腸中單核細胞增生李斯特菌的檢測

在BHI和顯色培養基上計數的菌落數（或典型菌落數）分別代表了樣品經UＶM、FB或MOPS-BLEB培養基培養後，所有微生物的總數和單核細胞增生李斯特菌的數量。法蘭克福香腸浸出液經增菌培養後，背景菌的濃度可達到10⁷～10⁸CFU/mL，而單核細胞增生李斯特菌的濃度約為10²～10⁴CFU/mL，背景菌在培養物中占據主導地位（表4）。由於高濃度背景微生物影響磁珠與目標微生物的結合，導致在第一步UＶM培養基中兩種磁珠的捕獲率均低於5%，甚至無法在瓊脂平板上分離獲得目標菌。經FB和MOPS-BLEB培養基二次增菌後，單核細胞增生李斯特菌的比例由第1次增菌前不足0.01%（濃度小於10⁴CFU/mL）迅速提升到20%～80%（濃度約為10⁶～10⁸CFU/mL），而背景菌的數量未見顯著增加（表4）。其中，經MOPS-BLEB培養後李斯特菌屬細菌的終濃度會高於FB培養基，並成為體係內優勢菌，具有較好的選擇培養性。

采用scFv-IMBs和Dyna-IMBs兩種磁珠捕獲後，通過顯色培養基和PCR檢測證實，磁珠捕獲方法對單核細胞增生李斯特菌的靈敏度可達1CFU/mL。兩種磁珠在MOPS-BLEB培養基中的捕獲率（62%～88%）明顯高於UＶM培養基（＜5%）和FB培養基（＜53%）中的捕獲率。

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