紅花，蛋白為一年生草本菊科紅花屬植物，酶酶植株呈冠狀，解红主莖強壯，花籽花絲多呈紅、工艺桔紅、条件桔黃、研究黃、蛋白淺黃、酶酶白等色。解红種子為瘦果，花籽種皮色分白、工艺灰、条件黑、研究黑褐，蛋白花期為每年的6～7月份，果期為8～9月份。紅花籽粕是紅花籽提油後的副產品，榨油後的紅花籽粕有兩種：即帶殼籽粕和去殼籽粕，其中帶殼的蛋白質含量為19%，而去殼的蛋白質含量高達40%。即使帶殼籽粕的營養價值也可以與苜蓿相媲美，在畜牧業中用作飼料添加，可為肥育牲畜的飼料；而去殼籽粕則更與亞麻子油餅相似，在母雞飼料中可直接代替蛋白質添加。有報道稱，通過對部分市售紅花籽粕的研究，營養指標測定如下：其中粗蛋白質20%、粗纖維31%、粗蛋白消化率78%、粗纖維消化率14.3%，由於其消化率較高，特別適用於作為奶牛飼料，對產奶量及品質都有很大程度的提高，是一種非常具有開發價值的副產品；紅花籽粕所含蛋白氨基酸屬於完全氨基酸，含有人體所需的18種氨基酸，其中8種必需氨基酸含量較高，約占氨基酸總量的30%左右；此外，紅花籽粕在農業中可用做抗凍劑、抗蟲劑和有機肥料等。
紅花籽粕含有豐富的蛋白，其製備成的抗氧化肽具有較強的還原力，國內對紅花籽粕蛋白利用研究的比較少，為提高紅花籽粕利用前景，本研究選取木瓜蛋白酶，並加入超聲輔助水解，對紅花籽粕蛋白的提取工藝進行優化，為紅花籽粕的綜合利用及開發相關高附加值的功能性食品提供技術依據。
紅花籽粕：新疆產地；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶：上海多比實業有限公司；三氯化鐵、鐵氰化鉀、30%過氧化氫、硫酸、硼酸、鹽酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、酚酞、三氯乙酸、甲醛、堿性品紅、磷酸二氫鈉：購於鄭州萊博儀器設備有限公司；試劑均為分析純。UNIVERSAL320高速冷凍離心機：Hettich有限公司；AUY120分析天平：SHIMADZUCORPOPATIONJAPAN；722E可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；ALPHAL-2真空冷凍幹燥機：德國M.CHRIST公司；HH恒溫水浴鍋：江蘇金壇中大儀器廠；PHS-25酸度計：上海雷磁儀器廠：C21-IH02E9電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司；YP202N電子天平：上海精密儀器儀表有限公司。
pH7.0磷酸鹽緩衝液：量取61mL的0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液和39mL的0.02mol/L磷酸二氫鈉，混合均勻，即為pH7.0磷酸鹽緩衝液。
0.02mol/L氫氧化鈉標準溶液：稱取0.8g氫氧化鈉溶於水，定容至100mL。0.05mol/L甘氨酸標準溶液：準確稱取375mg甘氨酸，溶解後定容至10mL。400mL中性甲醛溶液：在50mL36%～37%分析純甲醛溶液中加入1mL0.5%酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氫氧化鈉溶液滴定到微紅，貯於密閉的玻璃瓶中。
提油後的紅花籽粕用高速粉碎機進行粉碎，過50目篩，取2.5g紅花籽粕於小燒杯中，加入50mLpH7.0的磷酸緩衝溶液，於水浴鍋55℃水解1h，滅酶活（100℃，10min）在10000r/min轉速下冷凍離心15min，取上清液，備用。
準備6支幹淨的試管，分別取酶液1mL於試管中，木瓜酶液、中性酶液、胰蛋白酶液各兩支試管，其中三支作空白對照，另外三支依次加入3mLpH7.0磷酸緩衝液，37℃水浴鍋中預熱10min，加入pH7.0磷酸緩衝液配製的1%酪蛋白溶液1mL，搖勻，37℃水浴10min或55℃條件下用超聲波處理10min，，取出加入10mLTCA（三氯乙酸）溶液終止反應，劇烈搖動，37℃水浴半小時，冷凍離心取上清液作7倍稀釋，275nm處測吸光度值A。空白對照：在加入底物之前加入TCA溶液。
準備6支幹淨的試管，分別取酶液1mL於試管中，木瓜酶液、中性酶液、胰蛋白酶液各兩支試管，其中三支作空白對照，另外三支依次加入3mLpH7.0磷酸緩衝液，37℃水浴鍋中預熱10min，加入pH7.0磷酸緩衝液配製的1%酪蛋白溶液1mL，搖勻，37℃水浴10min或55℃條件下用超聲波處理10min，，取出加入10mLTCA（三氯乙酸）溶液終止反應，劇烈搖動，37℃水浴半小時，冷凍離心取上清液作7倍稀釋，275nm處測吸光度值A。空白對照：在加入底物之前加入TCA溶液。每分鍾水解產生1µg酪氨酸所需的酶量，即為1個酶活單位（U）。由酪氨酸標準曲線方程（A=aC+b）及酶活定義推得：
酶活=（A-b）×N/（a·水解時間）（1）
式中N為稀釋倍數8；
A為吸光值；
酶活單位為U/mL。
（4）L-酪氨酸標準曲線的建立
準確稱取於105℃幹燥至恒重的L-酪氨酸0.1g，用20mL1mol/L鹽酸溶解後，再用蒸餾水定容至100mL，即為1mg/mL酪氨酸標準溶液。吸取1mg/mL酪氨酸標準溶液10mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100mL，即得到100µg/mL的L-酪氨酸標準液。分別吸取100µg/mL的L-酪氨酸標準液0、1、2、3、4、5、6mL於10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，製成每毫升分別含L-酪氨酸0、10、20、30、40、50、60µg的標準使用液，在275nm下測定各濃度酪氨酸溶液的吸光值，以酪氨酸濃度為橫坐標，以該濃度下溶液所對應吸光度為縱坐標作標準曲線，計算回歸方程和R2值。
水解度DH=遊離氮/總氮
①測總氮量（凱氏定氮法）
參考GB5009.5進行總氮的測定，在進行樣品測定的同時做試劑空白，計算總氮含量。
移取2mL抽濾的水解液，分別置於250mL的錐形瓶中，加水25mL；其中一份加3滴中性紅指示劑，用標定的NaOH溶液滴定至琥珀色為終點。另一份加入中性甲醛10mL及3滴百裏酚酞指示劑，搖勻，靜置1min，（此時藍色消失）。再用上述標定過的NaOH溶液滴定至淡藍色。記錄兩次滴定所消耗的NaOH的毫升數，計算遊離氮的含量。
配製一係列濃度為5%的紅花籽粕底物溶液（取2.5g籽粕，加緩衝液50mL），分別加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，先調節pH，進行超聲波處理10min，水解反應1h，反應結束以後經過100℃滅酶處理10min，在10000r/min轉速下進行冷凍離心，時間為15min，上清液經過冷凍幹燥後備用。選用上清液來測定酶解液的還原能力。
取上清液備用，將酶解液稀釋1倍，取1.0mL紅花籽粕酶解液於10mL的試管中，依次加入0.2mol/LpH6.6的磷酸鹽緩衝液2.5mL、質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL並且充分混合均勻，於50℃條件下水浴保持20min，並迅速冷卻，然後加入質量分數為10%三氯乙酸溶液2.5mL，並且充分混合均勻，在3000r/min轉速冷凍離心10min。吸取離心後的上清液2.5mL，加入蒸餾水2.5mL和質量分數為0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，靜置10min，在700nm波長下測定溶液吸光值，所有測定值均為三次數據平均值。以700nm波長處的吸光值大小來反映酶解液的還原力的大小，吸光值越大，表明酶解液的抗氧化性越強。
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