芫荽為葉菜類,不同其表麵微生物數量多,减菌剂对菌效種類複雜。鲜切微生物的芫荽侵染不僅會影響芫荽的外觀,實質上也降低了食用價值,不同減少貨架期時間”。减菌剂对菌效芫荽種植的鲜切土壤、氣候等環境條件不同,芫荽隨著種植技術的不同提高與範圍的擴大,鮮切加工規模的减菌剂对菌效不斷擴大,從田間到餐桌的鲜切環節增多,這些都增加了鮮切芫荽微生物汙染的芫荽風險,也增加了微生物控製的不同難度。
次氯酸鈉、减菌剂对菌效氯氣、鲜切次氯酸鈣等能在水中產生次氯酸的殺菌劑總稱為含氯殺菌劑,其中次氯酸鈉是目前應用最廣泛的含氯殺菌劑。此殺菌劑以氯為主,在水溶液中形成有強氧化性的次氯酸,次氯酸可穿透微生物的細胞膜進人細胞,與胞內蛋白質產生氯化反應從而凝固細胞液,可有效殺死細菌,效果明顯且反應速度快。目前,很多企業主要使用次氯酸鈉作為殺菌劑,並主要監測菌落總數與大腸菌群的控製情況。由於次氯酸鈉可能存在氯殘留而對人體健康產生危害嘲,因此需要擴充綠色安全的殺菌劑種類,不斷挖掘新的殺菌劑並嚴格控製其使用濃度。
過氧乙酸是一種酸性強氧化劑,易溶於水、乙醇、乙醚、硫酸等溶劑,有強烈的刺激性酸味,對人的眼睛、皮膚、黏膜和上呼吸道有刺激作用,性質不穩定,遇熱或有機物、金屬離子、強堿等易分解。
過氧乙酸可殺滅細菌繁殖體、真菌、病毒、分枝杆菌、細菌芽孢等微生物,且在低溫下仍有效,其殺菌效果受濃度、溫度、相對濕度、有機物等因素影響網。過氧乙酸在質量濃度為50mg/1下就能達到良好的殺菌效果,幾乎對所有鮮切果蔬表麵的腐敗菌和致病菌有明顯抑製效果,但因其穿透力不強,低濃度下雖對懸浮的微生物效果明顯,而對緊緊吸附在鮮切產品表麵的微生物作用不明顯嘲。過氧乙酸反應的副產物是水和氧氣,對人體和環境無毒無害,因此被認為是一種綠色環保的殺菌劑,FDA已將其定為非衝洗食品接觸表麵消毒殺菌劑。過氧乙酸作為氯係殺菌劑的替代品,在鮮切果蔬加工中得到廣泛研究與應用。
與含氯製劑相比,二氧化氯不會與有機物反應生成致癌、致突變、致畸的物質,是目前國際上公認。的最新一代高效、廣譜、安全的殺菌保鮮劑同。它能迅速氧化病毒蛋白質衣殼中的酪氨酸,抑製病毒的特異性吸附,阻止其對宿主細胞的侵染,還能與細菌及其他微生物蛋白質中的部分氨基酸發生氧化還原反應,分解破壞氨基酸,抑製微生物蛋白質合成,從而導致微生物死亡。許多歐美國家有關組織已批準和推薦二氧化氯用於食品的消毒、防腐、保鮮等,世界衛生組織(WH0)已將二氧化氯列為A1級安全高效消毒劑,我國衛計委也已批準二氧化氯為消毒劑和新型食品添加劑。
上述3種減菌劑在鮮切芫荽中的減菌效果還缺乏研究,因此作者采用次氯酸鈉、二氧化氯和過氧乙酸處理鮮切芫荽,確定適合於鮮切蕪荽的最佳減菌劑,通過16SrDNA全基因組測序技術鑒定鮮切芫荽表麵細菌種類,分析主要致病與致腐細菌,以期更有效地提高鮮切芫荽產品的安全性。
芫荽:市售。
次氯酸鈉、二氧化氯、過氧乙酸、氯化鈉、胰蛋白腖、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、乳糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、月桂酸硫酸鈉、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養基、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、牛肉膏、蛋白腖、結晶紫、草酸銨、碘片、碘化鉀、番紅、鬆柏油、SK1201-UN10-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒等。
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挑選無黃葉、無機械傷、無病蟲害、新鮮度基本一致的本地鮮切芫荽,去根,清水洗至可直接食用,晾幹至無水漬,待用。
次氯酸鈉(5.2mg/1)配製成質量濃度為0、50、100、150、200、250mg/1的溶液,測定pH分別為6.32、10.33、11.37、11.70、11.90、12.07。
二氧化氯(8mg/1)配製成質量濃度為0、20、40、60、80、100mg/1的溶液,測定pH分別為5.90、3.16、2.87、2.73、2.56、2.41。
過氧乙酸(15.7mg/1),由A液(冰醋酸和硫酸)和B液(過氧化氫)以體積比10:8製得1000mg/1溶液,反應24h後稀釋成0、50、100、150、200、250mg/1,測定PH分別為6.93、4.79、4.03、3.78、3.60、3.52。
1.3.23種減菌劑處理
比較3種減菌劑減菌效果,選擇效果最佳的減菌劑,以優化減菌劑處理參數。3種減菌劑處理條件見表1。所有處理在室溫下進行,每個處理重複3次。
按照19(34)正交表,對處理濃度(20、40、60mg/1)、處理時間(2、5、10min)、水菜體積質量比(4m1:1g、8m1:1g、12m1:1g)三因素進行正交試驗,對照組為清水洗前及清水洗後待用的樣品。正交試驗表見表2。
參照GB/T4789.2-2016。
參照GB/T4789.3-2016。
無菌環境下,稱取25g鮮切芫荽置盛有225m1無菌生理鹽水的錐形瓶中,置於搖床80r/min,搖動20min,立即將樣品液稀釋至1×10-3、1×10-1、1×10-5二三個梯度,吸取1m1樣品勻液於無菌平皿內,每個稀釋度做2個重複同時,分別吸取1m1無菌生理鹽水加入2個無菌平皿內作空白對照。及時將牛肉膏蛋白腖培養基傾注平皿,並轉動平皿使其混合均勻。於(36±1)℃倒置恒溫培養(48±2)h。試驗重複3次、觀察細菌的生長情況及菌落的顏色和特征,並選取優勢菌挑取單菌落,采用平板劃線法於牛肉膏蛋白腖培養基劃線純化。於(36±1)℃倒置恒溫培養(48±2)h。連續純化5代。
挑取純化第5代的單菌落接種於牛肉膏蛋白腖斜麵,於(36±1)℃倒置恒溫培養(24±2)h。置於4℃冰箱中保藏。
觀察純化第5代平皿內菌落大小、菌落形態、菌落顏色、菌落表麵特征(光滑與否、幹燥與否、是否凸起、是否透明、是否存在同心環等)、邊緣規則與否。
參照CB/T4789.28-2013。
1.7 16SrDNA序列的分析及其係統發育樹的建立
1.7.1 DNA提取
參照上海生工SK1201-UNIQ-10柱式細菌基凶組DNA抽提試劑盒說明書操作。
正向引物27F:5’-AGACTTTCATCCTGGCTCAG-37;反向引物1492R(1510):5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
模板DNA10pmo1,上遊引物1μ1,下遊引物1μ1,dNTPMix1μ1,10×TaqreactionBuffer5μ1,高保真聚合酶(5U/μ1)0.25μ1,無菌超純水補足至50μ1。
98℃預變性5min:95℃變性35s,55℃退火35s,72℃延伸90s,35個循環;延伸8min。
將PCR產物送到測序公司進行測序。將測序完成的16SrDNA序列在GenBank(NCBI)中進行B1AST檢索,尋找相似序列並下載,用MEGA軟件製作係統發育樹確定細菌種屬。
數據取3次重複平均值,采用Exce1、SPSS18.0、正交設計助手等軟件對數據進行分析。
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