采用BrownleeCPPC18柱(2.1mm×50mm，分散1.7μm)進行分離，固相高效該色譜柱對極性和非極性化合物均有較好的结合保留，由於C18柱可能對含有長鏈烷基的液相季銨鹽保留作用較強，洗脫所需時問較長，色谱容易引起色涪峰形拖尾。分散為了改善色譜峰形，固相高效實驗時在流動相中加入了乙酸銨，结合為了驗證這一猜想，液相本實驗同時考察了日標分析物在甲醇-水、色谱甲醇-5mmol/L乙酸銨水溶液、分散5mm01/L乙酸銨甲醇溶液-5mm01/L乙酸銨水溶液等i種流動相體係下的固相高效色譜分離效果，結果發現未加入乙酸銨時，结合含有長鏈的液相季銨鹽均有不同程度的拖尾，僅在水相中加入乙酸銨時也存在輕微的色谱拖尾現象，同時在水相和甲醇相中加入乙酸銨時月標物的峰形對稱。實驗繼續考察了加入乙酸銨量分別為2.5、5、7.5、10mm01/L時色譜分離的效果，結果表明當乙酸銨在濃度為5和7.5mmol/L時，各季銨鹽均能得到良好分離，且色譜峰尖銳，響應最為靈敏，最終選擇了5mmol/L乙酸銨甲醇溶液和5mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相。
適當的梯度淋洗程序能夠使目標物在最短的時問內得到更好的分離，優化後的梯度程序BrownleeSPPC18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)。梯度淋洗：A-5mmol/L乙酸銨水溶液，B-5mmol/L乙酸銨甲醇溶液；0.00～0.50min，30％A；0.50～3.00min，30％～10％A；2.00～4.00min，10％～2％A；4.00～6.50min，2％～0A；6.50～6.60min，0～30％A；6.60～7.00min，30％A；柱溫箱溫度：40℃色譜條件。實驗同時考察了柱溫箱溫度為20、30、40、50℃時的情況，未能使實驗結果出現明顯變化，考慮到實驗需要保持各項參數的穩定，故選擇接近室溫的20℃作為柱溫箱溫度。
季銨鹽易失去鹵素離子得到正離子，故選擇EST+模式進行掃描。將配製好的各季銨鹽抑菌劑標準溶液通過針泵引入的方式注入離子源進行離子化，先用Ql全掃捕確定標準品中目標物的[M-X]+的母離子峰，調整流速、入口電壓(entrancev01tage，EV)、電離電壓等參數使母離子峰達到最大值，再用子離子掃描模式，改變碰撞電壓(c011isionv01tage，CE)值，選擇兩對信號最強、最穩定的子離子作為定性定量離子，優化其碰撞能量，使離子對的信號強度達到最大值，確定好以上參數後，采用多反應峪測模式(multiplereactionmonitoring，MRM)進行檢測，各子離子的駐留時問為100ms。最終在優化的色譜、質譜條件下，得到如圖1所示的各標準物質濃度為10μg/L時的多反應監測色譜圖。TAC出峰快，保留時間0.74min，BDAB保留時間2.71min，DTAC保留時間2.42min，TDBAC保留時間3.19min，BDHAC保留時問3.74min，DDAC保留時問3.30min，六種季銨鹽類抑菌劑在優化的條件下分離效果好，峰形對稱。
通過對6種季銨鹽類抑菌劑的極性考察，試驗了水、乙腈、甲醇和乙醇4種極性溶劑對目標物的提取效果。結果如圖2所示，其中水和乙醇的提取效果相對不佳，乙腈的提取能力優於水和乙醇，甲醇對6種季銨鹽抑菌劑的提取效果最佳，可能是甲醇自身良好的滲透性和合適的極性使得其對目標物提取能力較強。
本研究同時考察了提取劑體積對目標物提取效果的影響，選取了5、7.5、10、12.5、15mL不同體積的甲醇作為實驗條件。實驗結果如圖3所示，甲醇的提取能力隨著體積的增加而增強，於10mL處趨於飽和，隨著體積的繼續增加，部分目標物如BDAB、DDAC的相對豐度反而下降，可能是過量甲醇提取引起的基質效應導致。綜上所述，本研究最終選取10mL甲醇作為本方法的最終優化條件。
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