7、酪蛋體外模擬肽-鋅螯合物胃腸消化及鋅解離率測定
將製備的白肽肽-鋅螯合物溶於pH2.0，37℃去離子水中，电荷对充分混勻後向其中添加2％(w/w)的性质胃蛋白酶，在37℃條件下水浴搖床酶解2h。酪蛋水解液用分子截留量為500Da的白肽透析袋透析5h，收集透析液，电荷对利用原子吸收分光光度計測定其中遊離鋅的性质含量，評價肽-鋅螯合物在胃消化過程中的酪蛋穩定性，同時收集透析袋內剩餘物質冷凍幹燥備用。白肽
將經過胃蛋白酶消化後的电荷对肽-鋅螯合物溶於37℃，pH7．0的性质水溶液中，充分混勻後添加2％(w/w)的酪蛋胰酶，在37℃條件下水浴搖床酶解3h。白肽
隨後水解液用分子截留量為500Da的电荷对透析袋透析5h，收集透析液，利用原子吸收分光光度計測定其中遊離鋅的含量，評價肽-鋅螯合物在腸消化過程中的穩定性，同時收集透析袋內剩餘物質冷凍幹燥備用。
在模擬胃腸消化過程中，鋅的解離率定義為在胃腸消化過程中釋放遊離鋅的量占消化前酪蛋白肽-鋅螯合物中鋅的總量的百分比。
8、肽-鋅螯合物中鋅的生物利用率
Caco-2細胞培養於25cm2細胞培養瓶中，培養液為含有10％胎牛血清，1％非必須氨基酸，100U/mL青黴素和0.1mg/mL鏈黴素的高糖培養基。培養條件為37℃，相對濕度90％，CO2濃度為5％。當細胞在培養瓶中分布80％時，用含0.5％EDTA的胰酶消化細胞，然後以4-5×105cells/mL的濃度接種於6孔Transwell培養板中。
每隔2d換一次培養液，直至細胞培養21d。然後棄去培養液，用HBSS清洗細胞2-3次，在細胞模型上側和下側分別添加1.5mL和3mLHBSS溶液。將經胃腸消化後肽一鋅螯合物添加至上側，使其終濃度為1.5mg/mL，隨後將添加了樣品的Transwell培養板在37℃下吸收轉運2h，收集培養板下側的溶液進行透析，分別收集透析液和透析後的保留物，然後利用原子吸收分光光度計測定其中鋅的含量，與吸收之前比較，計算經吸收過程後遊離鋅的含量及螯合物中鋅的生物利用率。
9、數據處理與統計分析
數據結果表示為平均值±標準誤的形式。采用SPSS19.0(SPSSInc，Chicago，IL)進行數據處理分析，利用Duncan檢驗分析各組數據見的顯著性差異(α=0.05)。
三、結果與分析
1、酪蛋白肽的分離純化
酪蛋白水解物經SephadexC25凝膠柱分離後的譜圖如圖1所示。由圖1可知，共分離得到4組酪蛋白肽組分，F1和F2組分是由流動相20mM，pH4.0的醋酸緩衝液洗脫獲得；F3和F4組分是由流動相20mM，pH4.0的醋酸緩衝液和0.5MNaCl共同洗脫獲得。本實驗中分離酪蛋白肽采用的陽離子交換柱層析，以SPsephadexC-25作為固定相，其中以帶負電荷的磺酸基(一SO3H)為主要功能團，通過靜電相互作用對物質進行分離。因此，F1和F2組分最先被洗脫下來，帶有較多的負電荷；F3和F4組分則帶有較多正電荷。由於F3和F4組分的洗脫液中含有NaCI，這兩組分需要經過脫鹽處理。收集足夠量的肽組分後，調節pH為7.0，冷凍幹燥後在一80℃條件下存放備用。
2、酪蛋白肽組分的ζ電勢
分離得到的4組酪蛋白組分的表麵電荷性質通過ζ電勢進行確定。由圖2可知，從F1到F4組分的ζ電勢逐漸增加，分別為-43mV，-32mV，-11mV和3mV，且相互之間存在著顯著性差異(P＜0.05)。這一測定結果與上述酪蛋白肽組分的分離純化相符合，F1和F2組分帶有較多負電荷，ζ電勢較低；F3和F4組分最後從SPsephadexC-25陽離子交換填料上洗脫下來，所帶負電荷相對較少，因此ζ電勢較高。不同的ζ電勢表明酪蛋白肽組分在水溶液中穩定性不同，同時也會影響肽與金屬離子之間的相互作用以及形成金屬螯合物的穩定性。例如，有學者研究發現由於含有較多帶負電荷的磷酸基團，酪蛋白磷酸肽在pH變化的條件下仍然能夠與鐵形成穩定的複合物。因此，由於ζ電勢的不同，本實驗中分離得到的酪蛋白肽組分螯合鋅離子的能力以及形成肽鋅螯合物的穩定性會存在較大的差異。
3、酪蛋白肽組分的氨基酸組成
活性肽的帶電性質在宏觀上反映了其氨基酸組成的差異。帶有負電荷的組分含有相對較多的酸性氨基酸，而帶有正電荷的組分含有相對較多的堿性氨基酸。采用柱前衍生法對分離得到的酪蛋白肽組分的氨基酸組成進行分析，結果如表1所示。F1-F3組分中酸性氨基酸含量高於堿性氨墓酸含量。其中，F1組分中酸性氨基酸(Asp和Glu)含量占總氨基酸含量的42.64％；F2組分中酸性氨基酸含量占33.84％；F3組分中堿性氨基酸(His、Arg、Lys)含量明顯高於F1和F2組分，達到15.33％。因此，F1、F2和F3可看做帶負電荷的組分，掌電勢較低。F4組分中堿性氨基酸含量高於酸性氨基酸含量，堿性氨基酸占氨基酸總數的37.90％。F4為帶正電荷組分，亭電勢較高。此外，有研究報道，具有結合二價金屬離子能力的氨基酸殘基包括Asp、Glu、His、Ser、Cys、Asn和Gin，這些氨基酸殘基在4組酪蛋白肽組分中的含量分別為55.5％、40.4％、29.4％和26.1％。再結合氨基酸組成分析可知，分離得到的4組酪蛋白肽組分都可以螯合鋅離子，並且螯合鋅的能力從F1組分到F4組分逐漸減弱。
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