1.3.5 結合常數和結合位點數的栀黄制动計算

結合常數結合位點通過以下方程描述：

式（6）中：Ka—梔子黃與α-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶的結合常數；n—結合位點數。

1.3.6 熱力學參數評價

小分子與生物大分子之間可通過疏水鍵、对淀的抑靜電引力、粉消範德華力和氫鍵等發生相互作用。化酶互作熱力學參數焓變ΔH和熵變ΔS可根據Van’tHoff方程確定：

式（7）中：R—大氣常數，力学其值為8.314J/（mol·K）；T—反應溫度（303和310K）；Ka—結合常數。及相究自由能ΔG由下式計算：

ΔG=ΔH-TΔS           （8）

ΔH和ΔS的用研值由lnKa對1/T的線性圖的斜率和截距計算。

1.3.7 梔子黃與澱粉消化酶相互作用的栀黄制动結合距離

以水為參比，在300～500nm波長範圍內掃描梔子黃的对淀的抑紫外光譜，並根據α-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶的粉消熒光光譜和梔子黃的紫外吸收光譜的重疊圖譜計算結合距離。熒光共振能量轉移（FRET）是化酶互作一種距離依賴的相互作用，它是力学由供體分子（蛋白質）向受體分子（藥物）非輻射傳遞的激發能。能量傳遞效率可以用來評價配體與蛋白質中色氨酸殘基之間的及相究距離。

非輻射能量轉移將發生在供體（α-澱粉酶或α-葡萄糖苷酶）和受體梔子黃之間，用研而條件是栀黄制动（a）供體可產生熒光；（b）供體的熒光發射光譜和受體的吸收光譜有部分重疊；（c）供體和受體之間的距離約小於8nm。根據F觟rster非輻射能量轉移理論，能量轉移效率（E）不僅與受體和供體之間的距離（r）有關，而且與臨界能量轉移距離（R0）有關，即：

式（9）中：R₀—轉移效率為50%時的臨界距離，nm；r—受體與供體之間的距離，nm。

式（10）中：K²—供體與受體各項隨機分布的空間取向因子；N—介質的折射率；φ—不存在受體的情況下供體熒光量子產率；J—供體熒光發射光譜和受體吸收光譜之間的重疊積分；其計算公式如下：

式（11）中：F（λ）—熒光供體在波長λ的熒光強度；ε（λ）—受體在波長λ下的摩爾吸光係數。能量轉移效率E計算公式為：

式中：F₀和F與方程式（5）中的相同。

1.3.8 統計分析

使用origin2017作圖，使用SPSS21統計軟件包分析所有數據，結果表示為平均值±標準偏差（n=3）。P＜0.05被認為是顯著差異。

2 結果與討論

2.1 抑製動力學研究

本研究用澱粉和pNPG作為底物得到α-澱粉酶和α-葡糖苷酶的Lineweaver-Burk圖，並確定其抑製類型，結果見圖1和表1。對α-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶來說最大速度（V_max）值為0.52和3.11×10^-2mg/（mL·min）保持不變，不同濃度的梔子黃存在均使米氏常數（Km）增加表明：梔子黃在兩種酶（α-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶）分子上與酶底物結合位點競爭結合並形成複合物，繼而通過減少底物與酶的結合來降低酶促速率。即梔子黃與α-澱粉酶以及α-葡萄糖苷酶的活性中心結合，從而產生對酶蛋白活性的影響。這與多酚類物質抑製澱粉消化酶類似。競爭性抑製常數K_ic是抑製劑-酶複合物的解離常數，因此，1/K_ic代表抑製劑與酶的締合常數；K_ic值較低意味著抑製劑與酶活性位點的結合親和力較高。梔子黃對α-澱粉酶的K_ic（1.47）大於α-葡萄糖苷酶K_ic（0.58），意味著梔子黃對α-葡萄糖苷酶的結合親和力更高。

2.2 熒光光譜分析

圖2、圖3反映了不同濃度的梔子黃在不同溫度下對α-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶之間的熒光光譜圖。隨著梔子黃濃度的增大，α-澱粉酶和α葡萄糖苷酶的熒光強度呈現不同程度的降低，即熒光猝滅現象。此外，圖2和圖3發現α-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶的最大發射峰所處的波長發生紅移，說明梔子黃與兩種澱粉消化酶發生相互作用。為了闡述作用機製，使用Stern-Volmer方程分析熒光數據。

圖4的Stern-Volmer圖可以看到梔子黃對α-澱粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer的曲線是向y軸彎曲的曲線。熒光測量提供了有關發色團分子附近分子環境的信息。蛋白質熒光強度的降低稱為蛋白質熒光猝滅，這種猝滅可通過不同的機製，碰撞猝滅（動態猝滅）是激發態熒光團與溶液中的其它分子（猝滅劑）接觸而失活時發生。靜態猝滅為熒光團與猝滅劑形成非熒光配合物。線性Stern-Volmer曲線表明蛋白質中有一類熒光團以相同的方式與淬滅劑相互作用，並且隻有一種淬滅機製（動態或靜態）發生。然而，當淬滅程度較大時，經常觀察到方程的正偏差。在這種情況下，F0/F與[Q]描述了一條向上的曲線，向y軸凹陷。通常，向上彎曲表明有幾種機製負責蛋白質中熒光團的猝滅效應（既有動態猝滅又有靜態猝滅），或者它表明存在“作用域”（作用範圍），即表觀靜態猝滅。描述這種情況的Stern-Volmer方程的修改形式如下：

將此方程兩邊取自然對數，作ln（F₀/F）與[Q]的圖，得到一條直線，該直線斜率即為表觀靜態常數KSV即：

生物高聚物在不同的猝滅劑最大動態猝滅常數是2×10¹⁰mol^-1s^-1，表2中梔子黃對α-澱粉酶的猝滅常數（1.40×10¹¹mol^-1s^-1/1.26×10¹¹mol^-1s^-1）和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅常數（2.92×10¹¹mol^-1s^-1/5.10×10¹¹mol^-1s^-1）遠大於2×10¹⁰mol^-1s^-1，說明了猝滅方式是靜態猝滅為主，此外，猝滅常數反映了猝滅劑與生物高聚物的親和性，α-葡萄糖苷酶的猝滅常數大於α-澱粉酶，說明梔子黃對α-葡萄糖苷酶有更好的親和力。也印證了2.1節抑製動力學上梔子黃對α-葡萄糖苷酶有著更好的抑製作用。

相關鏈接：α-葡萄糖苷酶，α-澱粉酶，梔子黃

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