曲黴型豆豉的常压生產可以追溯至戰國時代，在中國有著悠久的室温术选曆史。傳統曲黴型豆豉采用自然接種製曲，等离豆豉曲醅添加輔料後熟而成，体诱具有營養豐富、变技風味獨特的育曲研究特點及保健功效。米曲黴作為曲黴型豆豉發酵的霉型優勢微生物，其酶係豐富，发酵可在豆豉製曲階段積累多種酶類，菌种其中的常压蛋白酶係（酸性、中性、室温术选堿性）尤為重要，等离豆豉對豆豉的体诱品質起到決定性作用。而在豆豉製曲過程中，变技米曲黴主要產中性蛋白酶，育曲研究其活性的高低決定了豆豉發酵成熟的周期和質量，此酶可將大豆蛋白降解為多肽、遊離氨基酸等，對豆豉的營養及風味形成起到重大作用。
在工業化生產的背景下，采用純種發酵對我國豆豉企業標準化生產具有重要意義。而優良的菌種除了產蛋白酶等酶係能力強，還應該具備生長速率快、產孢子能力強等特點，產孢子能力強的菌種更容易成為發酵過程中的優勢菌種，抑製其它菌種的生長和繁殖，減少雜菌汙染，縮短發酵周期，提高生產效率。但天然菌株產酶能力較差，難以適應工業化生產，因此科研工作者進行了大量的菌種改良工作。夏楊振興通過對米曲黴中性蛋白酶I基因進行定點突變，對構建好的畢赤酵母Gsll5基因工程菌進行甲醇誘導，發現增加糖基化位點後的突變酶活力較野生型提高了11.5％
然而基因工程菌株在實際的生產應用受到很大的限製，目前在米曲黴的育種方麵依然采用的是經典的物理化學誘變，而清華大學研發的常壓室溫等離子體誘變技術作為一種新型的誘變技術，相比於傳統的誘變手段，其具有基因損傷強度高、突變範圍廣、安全便捷的優勢，顯著提升了菌株的突變率，近年來廣泛應用於微生物育種領域。該技術的誘變原理基於大氣壓射頻輝光放電產生的等離子體（ARTP），等離子體產生的大量活性粒子與微生物細胞及周圍基質作用，產生大量的活性氧、活性氮自由基，並改變細胞膜的通透性，這些活性粒子和氧化自由基進入細胞，與DNA、蛋白質等生物大分子作用造成DNA的直接和間接損傷，引起細胞的SOS等多種保守和非保守的修複機製，從而引起高效突變。
曲黴型豆豉對感官品質要求嚴格，對其組織形態要求顆粒完整、鬆散成型，因而其生產必須由整粒大豆經蒸煮，之後發酵製成。由於物料的形態缺陷導致固態發酵過程中與微生物接觸空間有限及傳質不均勻，進而導致了曲黴型豆豉了曲醅蛋白酶活力較低。因此本文利用ARTP誘變技術選育高產中性蛋白酶活力米曲黴菌株，並用整粒大豆製作複篩培養基進行酶活驗證，以期提升曲醅的中性蛋白酶活力，為曲黴型豆豉純種發酵奠定一定的理論基礎。
一、材料和方法
1、菌株
米曲黴（Aspergillus oryzae）NCU一110：從日本醬油釀造用菌粉中分離而來，經擎科生物測序，測序結果在NCBI網站進行BLAST比對後，其同源性與Aspergillus oryzae isolate F8160（Accessionnumber：MN429212.1）高達99.64％，鑒定為米曲黴，該菌株具有蛋白酶係完整，以產中性蛋白酶為主的特點。目前由南昌大學中德食品工程中心保藏。
2、試劑與儀器
磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、酪蛋白、三氯乙酸、福林酚試劑、酪氨酸、濃鹽酸（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；TGL一16B型高速離心機：美國賽默飛世爾科技公司；
SP—756P紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；HWS—250恒溫恒濕培養箱：上海新苗實驗儀器有限公司。
3、培養基
（1）菌種活化及保藏培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）；
（2）初篩培養基：幹酪素4.009，磷酸二氫鉀0.369，磷酸氫二鈉1.079，氯化鋅0.049，氯化鈣0.0029，硫酸鎂0.59，氯化鈉0.169，硫酸亞鐵0.0029，胰蛋白腖0.03～0.059，瓊脂159，蒸餾水定容為lL，12l℃滅菌30min；
（3）複篩、製曲培養基：選取1509優質東北黃豆，清洗後用三倍體積的自來水於35℃浸泡3h，瀝幹後，121℃滅菌30min；
（4）種曲培養基：麩皮、豆粕、水質量比例為：80∶20∶80，500mL三角瓶裝量料509，水40mL，自然pH，121℃滅菌30min；
（5）察氏培養基：硝酸鈉3.09，磷酸氫二鉀1.09，氯化鉀0.59，硫酸鎂0.59，硫酸亞鐵0.019，蔗糖209，蒸餾水1L，將上述藥品按順序溶解後，加入209瓊脂加熱溶化，分裝後121℃滅菌30min。
4、 ARTP誘變
（1）米曲黴孢子懸浮液製備
取活化好的米曲黴NCU一110試管斜麵，用無菌生理鹽水衝洗即得孢子懸液，取樣進行血球計數板計數，將孢子懸液稀釋至106CFU/mL，備用。
（2） ARTP誘變條件的確定
采用氦氣為工作氣體，使載片與等離子體發生器射流出口間距約2mm，功率為120W，氣流量10L/min，對10μL孢子懸液進行誘變處理，設置誘變時間為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9min。梯度稀釋誘變後孢子懸液分別為4.0×104CFU/mL、4.0×103CFU/mL和4.0×102CFU/mL，各取100μL塗布於初篩培養皿，30℃避光恒溫培養3d，計算致死率，繪製致死曲線圖。
致死率=（對照菌落數一誘變平板菌落數）/對照菌落數×100％
5、高產中性蛋白酶活力菌株篩選
（1） 初篩方法
選擇最佳誘變時間下的孢子懸浮液，適當稀釋（4.0×102CFU/mL）後塗布於初篩培養基，30℃培養72h，觀察各個平皿中初篩菌株的透明圈和菌落大小，挑取菌落較大並且透明圈明顯的60株米曲黴（編號NCU—A1-A60）單菌落接種於PDA試管斜麵，於30℃培養3～5d，待試管中突變米曲黴菌絲布滿黃綠色孢子，將60株米曲黴與原始菌株在初篩培養基上進行點種實驗，計算K值並取K值較大的18株突變菌株進行下一步複篩實驗。
K=透明圈直徑／菌落直徑，K值代表了菌株產蛋白酶的能力，可以用來判斷突變株產生蛋白酶活力的大小。
（2）淺盤製曲複篩高產中性蛋白酶活力突變株
將K值較大的18株初篩菌株活化，製備孢子懸液並稀釋至107CFU/mL。根據曲黴型豆豉淺盤製曲工藝，按照1.0％的接種量，前期發酵溫度控製在30～34℃，製曲至第18～24h，豆粒表麵布滿白色菌絲，進行第一次翻曲；當曲醅出現嫩黃孢子時，進行第二次翻曲，溫度控製在28～32℃。培養至72h取樣，采用SB/T 10317—1999中的福林酚法測定各菌株曲醅中性蛋白酶活力。
6、突變株遺傳穩定性驗證實驗
將複篩得到的數株中性蛋白酶活力顯著提高的突變株和原始菌株在PDA試管斜麵上30℃連續傳代9次，對上述菌株第1～9代豆豉曲醅的中性蛋白酶活力進行測定，檢測複篩菌株的遺傳穩定性。
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