2.6 指紋圖譜建立及分析
2.6.1 指紋圖譜的建立鹃素建立
取“2.1”項的對照品溶液和“2.2”項下供試品溶液，按“2.3.1”項的满山色譜條件，使用高效液相色譜儀檢測。红叶含量所得滿山紅葉HPLC對照圖譜見圖4，指纹15批滿山紅葉色譜疊加圖見圖5。图谱
圖4所示，并测該指紋圖譜找到10個共有峰，定杜通過與對照品色譜圖對比，建立鹃素確認10號峰為杜鵑素，满山並將9號峰作為參照S峰。红叶含量
2.6.2 相似度分析
采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價係統軟件”(2012版)，指纹采用中位數法依次進行15批滿山紅葉指紋圖譜的图谱相似度評價，結果見表9。并测根據表9能夠得出，定杜15批滿山紅葉紋圖譜整體相似度在0.986～0.999，建立鹃素均>0.9，具有較高的一致性。
2.6.3聚類分析
將15批滿山紅葉的10個共有峰峰麵積導入SPSS 20.0，運用平均歐式距離法，進行聚類分析，見圖6。分類結果表明不同產地滿山紅藥材在分類距離上較遠，即使同一產地其分類距離也存在明顯差異性。初步分析，可能與滿山紅藥材采摘時間、貯存方式、氣候等有關。15批滿山紅葉在產地和批次上其主化學成分種類具有代表性，指紋圖譜能夠反映出樣品的全貌。
3 討論
本實驗供試品的製作方法，考察了不同提取溶劑和提取方式對滿山紅葉指紋圖譜的影響。在提取溶劑方麵，選取了水、60%甲醇、稀乙醇三種溶劑作為提取溶劑，結果發現，滿山紅凍幹粉在三種溶劑中的溶解度都很好，但是以水作提取溶劑的色譜圖無論在出峰數目還是分離度上均優於其他兩種溶劑的色譜圖，因此選擇水作為提取溶劑。在提取方式方麵，選擇了超聲提取法和回流提取法，結果發現，2種方法提取的滿山紅葉色譜圖差別很小，但是超聲提取方法更加簡便，因此選擇超聲的方法作為提取方法。
本實驗對於色譜條件的確定，考察了色譜柱、檢測波長、流動相係統，流速、柱溫對滿山紅葉指紋圖譜的影響。在色譜柱方麵，選了Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）、Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm）和YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm,5μm）色譜柱，結果表明樣品在Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm）和YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm,5μm）中不能達到分離要求，而在Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱中不僅出峰快、數目多而且分離度符合要求，所以選擇Shim-Pack XR-ODSⅤ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱作為該實驗色譜柱。
在檢測波長方麵，用二極管陣列檢測器檢（DAD）中200～400 nm依次掃描對照品溶液和供試品溶液，結果顯示在檢測波長297 nm處2個樣品均有最大吸收，色譜圖信息豐富，杜鵑素峰高較高，所以選用297 nm為檢測波長。在流動相係統方麵，選取不同種類有機相（甲醇、乙腈）和不同成分水相（0.3%甲酸水溶液、0.3%醋酸水溶液）構成的流動相係統對供試品溶液色譜峰分離的影響，篩選乙腈-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3%醋酸水溶液等流動相係統，結果顯示，乙腈-0.3%甲酸水溶液流動相係統不利於樣品的分離，出峰數目稀少且分離度不好，甲醇-0.3%甲酸水溶液和甲醇-0.3%醋酸水溶液流動相係統對樣品分離差別不明顯，但是甲醇-0.3%甲酸水溶液流動相係統色譜圖信息更豐富，分離度更好，故確定該流動相係統作為該實驗檢測的流動相。在流速方麵，選擇了0.1 mL·min-1、0.2 mL·min-1、0.25 mL·min-1進行篩選。結果表明，用0.1 mL·min-1流速檢測色譜峰出峰不完全，用0.25 mL·min-1流速檢測色譜峰分離度不好，用0.2 mL·min-1流速檢測色譜峰出峰數目完全，分離度較好，故確定流速為0.2 mL·min-1。在柱溫方麵，對25℃、30℃、35℃柱溫進行篩選。結果表明升高柱溫，分離效果變差，因此確定了25℃作為檢測柱溫。
15批滿山紅葉的指紋圖譜整體相似度範圍0.986～ 0.999，均>0.9，相似度良好，15批滿山紅葉中杜鵑素含量RSD為0.11%，表明其含量沒有明顯差異，但是聚類分析結果將15批滿山紅葉分為四類，且10個共有峰峰麵積的RSD範圍6%～30%，說明杜鵑素的含量對其整體含量變化影響很小，其他化學成分含量變化起主要作用，初步分析應該與滿山紅中草藥產地、生長環境、采摘時間、放置條件和放置時間等有關。
本研究運用高相液相色譜分析法，建立了滿山紅葉的指紋圖譜，該指紋圖譜可以全麵展現滿山紅葉化學成分的特點，適用於因產地、批次、生長環境等因素的不同，出現的質量不均一的滿山紅葉。該方法簡便易行，指紋峰分離度好，具有較高的可信度，為後續滿山紅葉的研究開發提供科學依據。
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