複雜樣品中痕量農藥殘留的免疫分離、淨化和濃縮是亲和農藥殘留分析中最繁雜的工作，對分析的色谱术準確性和可靠性影響很大。傳統的分印分離淨化手段如液液分配、薄層色譜、迹技柱色譜淨化等費時費力，免疫需要使用較多的亲和有機溶劑，複雜的色谱术樣品前處理過程還容易造成痕量目標分析農藥的變性和損失。同相萃取等方法利用目標分析物與雜質理化性質的分印差異實現分離淨化，其選擇性仍然有限，迹技對於一些理化性質相近的免疫非目標分析物還是難以有效分離去除，對後續的亲和分析會產生幹擾。因此研究開發具有高選擇性分離富集功能的色谱术農藥殘留分離淨化技術是農藥殘留分析技術的重要研究內容之一。

一、分印免疫親和色譜

Axen等(1967)和Cuatrecasas(1968)的迹技開拓性工作奠定了免疫親和色譜(immuno-affinity chromatography，IAC)的研究基礎。從20世紀80年代後期開始，免疫親和色譜作為一項頗具發展潛力的高效分離富集技術受到關注，國內外已有不少關於應用免疫親和色譜法分離富集不同物質的文獻報道，對複雜樣品提取液中的目標分析農藥、獸藥、毒素、各種蛋白質等具有顯著的分離純化效果，富集效率高。蛋白質粗提液經過免疫親和色譜淨化，可達到電泳純水平，並具有很高的回收率。因此免疫親和色譜在醫學檢驗、食品衛生檢驗、環境監測等領域具有很高的研究應用價值。

(一)免疫親和色譜基本原理及主要特點

免疫親和色譜是利用抗原與抗體的高親和性、專一性和可逆結合的原理而建立的一種色譜方法。農藥的免疫親和色譜是以抗農藥特異性抗體為配體，將其固定到適當的固相載體上，製備免疫親和色譜固定相和免疫親和色譜柱，利用農藥小分子的反應原性和抗原抗體結合的特異性以及在一定條件下可逆解離的原理進行色譜分離。當含有目標分析農藥的粗提液經過免疫親和色譜柱時，樣液中對該抗體有親和性的農藥就被選擇性地結合到同定相上，淋洗去除非目標分析物後，在適當條件下用少量溶劑洗脫，可選擇性地分離富集目標分析農藥。免疫親和色譜通常隻需“加樣-洗滌-洗脫”一步色譜就可使複雜樣品中極微量的特定組分得到高度純化和濃縮，所得分離物比固相萃取物純度高，濃縮倍數可達數百甚至上千倍，便於直接采用氣相色譜、高效液相色譜等方法進行檢測，大大提高了樣品前處理效率，減少了有機溶劑的使用和提取過程中目標分析物的損失，具有特異性強、柱容量大、洗脫條件溫和等特點。免疫親和色譜柱還可以很方便地再生和重複利用，非常適用於複雜樣品中痕量農藥殘留的分離與富集，可有效降低樣品分析的檢測限，提高分析靈敏度。

(二)農藥免疫親和色譜法的建立

1、抗農藥抗體的製備與純化

在農藥的免疫親和色譜中，作為固定相配體的抗農藥抗體是最為關鍵的材料。合成保持並突出目標分析農藥結構特征的半抗原，將半抗原共價結合到一個大分子載體(如牛血清白蛋白等)上製備人工抗原，以人工抗原免疫動物或采用雜交瘤技術製備對目標分析農藥具特異性親和力的多克隆(polyclona1 antmody，PcAb)或單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)。從20世紀90年代開始，利用基因工程技術製備抗體的研究工作逐漸開展起來，這無疑會為規模化生產高性能抗體和免疫親和色譜柱開辟了一條新途徑。

抗體的純度是製備高容量、高選擇性免疫親和色譜柱的主要因素之一。采用硫酸銨三步鹽析法從抗血清中分離出的抗體，須進一步純化後才能作為配體，用於製備免疫親和色譜固定相。抗體的純化方法包括二乙氨乙基纖維素吸附法、離子交換柱色譜法及親和色譜法。二乙氨乙基纖維素對血清蛋白的吸附力遠高於對免疫球蛋白(IgC)的吸附力，可以有效去除血清中的非免疫球蛋白。蛋白A和蛋白G與IgC有很強的親和力，以蛋白A或蛋白G為配體的親和色譜，條件溫和，可以有效純化抗體並保持抗體的免疫學活性。以人工抗原作為配體的親和色譜，也是獲得高活性純化抗體的有效途徑之一。一般情況下，以農藥半抗原與載體蛋白的耦聯物為人工抗原，以該人工抗原免疫動物製備多克隆抗體，其中有一部分抗體可能是針對載體蛋白的。所以可在抗血清或多克隆抗體溶液中加入適量載體蛋白進行反應，然後離心去除載體蛋白一抗體複合物，再分離去除雜蛋白，可使抗目標分析農藥的特異性抗體得到純化。

2、免疫親和色譜固相基質的選擇

近年來，商品化的免疫親和色譜固相基質越來越多。理想的免疫親和色譜固相基質應該具備的條件有：①親水性好，以便與親水性的配體(抗體)和水溶液中的目標分析物有較好的相容性；②其載體本身對非目標分析物沒有吸附或非特異性吸附非常小；③具有適當數量的化學基團可供活化以便與適當數量的配體有效耦聯；④有較好的物理穩定性和化學穩定性，能耐受配體固定化和親和色譜中可能采用的各種條件(如pH、離子強度、溫度、洗脫劑等)的影響；⑤具有多孔的網狀結構，能夠耦聯更多的配體，被親和吸附的目標分析物能夠自由地通過，從而增大配體與目標分析物的結合量；⑥有良好的機械性能，能夠承受一定的柱壓，在使用條件下不變形，保持穩定的柱體積。為使流動相有較好的流速，免疫親和色譜固相基質最好是均一的球狀顆粒。

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