(4)免疫親和色譜柱的免疫再生與儲存農藥殘留免疫親和色譜柱的再生通常采用一定體積的極性有機溶劑(如甲醇等)洗柱，除去非特異性吸附的亲和雜質，然後再用10～15倍柱體積的色谱术平衡緩衝液衝洗免疫親和色譜柱。在溫和條件下，分印免疫親和色譜柱可再生使用多次。迹技暫不用使用時，免疫可用含0.02％疊氮化鈉或0.01％硫柳汞的亲和平衡緩衝液平衡色譜柱，於4℃冰箱中保存。色谱术

(三)免疫親和色譜技術在農藥殘留分析中的分印應用

目前國外已經研究開發了多種農藥的免疫親和色譜技術。Lawrence等(1996)采用免疫親和色譜反相液相色譜聯用檢測蘿b、迹技玉米、免疫草莓等樣品中殘留的亲和苯基脲類除草劑，檢測靈敏度可達2～5μg／kg，色谱术遠低於常規高效液相色譜的分印檢測限0.1mg／L。David等(1996)將水果提取液中殘留的迹技多菌靈用免疫親和色譜柱淨化濃縮，洗脫液采用高效液相色譜法檢測，檢測限可達0.1μg／kg。Rejeb等(2001)采用免疫親和色譜分離富集小麥、玉米、羊尿等樣品中殘留的咪唑啉酮類除草劑和花生中殘留的噻氟菌胺(thifluzamide)，Spinks等(1999)采用免疫親和色譜分離富集除草劑百草枯，均取得了良好的分離富集和檢測效果。

我國農藥免疫親和色譜技術研究不多，劉曙照等在我國率先建立了克百威(2005)、三唑磷(2006)和氯磺隆(2006)免疫親和色譜高效液相色譜聯用(IAC-HPLC)技術，分別用於環境水、稻米和農田土壤中克百威、三唑磷和氯磺隆殘留的分離富集、定性檢測和定量檢測。免疫親和色譜柱容量達1.58～2.6μg／mL柱體積，對目標分析農藥的富集倍數為160～250，回收率為90%～102％，經免疫親和色譜分離淨化的樣品中幾乎沒有幹擾高效液相色譜檢測的雜質，明顯優於固相萃取法的分離純化與富集效果。

(四)免疫親和色譜技術需要進一步解決的問題和發展方向

在農藥殘留分析中，免疫親和色譜主要作為樣品提取液中痕量農藥殘留的高效分離富集手段，然後與高效液相色譜、氣相色譜等方法聯用進行檢測，深受農藥殘留分析機構和技術人員的歡迎。

誠然，免疫親和色譜技術的開發應用中也存在一些局限性：①作為免疫親和色譜固相基質配體的抗體，其本質是具有生物活性的免疫球蛋白，對有機溶劑、鹽濃度、pH、溫度等條件的耐受範圍有限，在使用過程中容易失去活性，限製了免疫親和色譜的使用範圍和使用壽命；②目前所使用的免疫親和色譜柱需要有效避免固相基質對非目標分析物的非特異性吸附；③免疫親和色譜固定相製備需要較多的純化抗體，麵臨較高的成本壓力；④目前已研究開發的免疫親和色譜固定相耐壓性有限，還難以直接用作高效液相色譜柱進行在線分析。

因此，免疫親和色譜技術需要進一步解決的問題是：應用現代科學技術，研製能在比較苛刻的條件下保持高免疫活性的抗體；研製無非特異性吸附、耐壓性強、理化性能穩定、與配體相容性好的固相基質；優化配體與基質的耦聯方法，提高免疫親和色譜柱容量；研製免疫親和色譜柱穩定劑，延長色譜柱的使用壽命，增加免疫親和色譜柱的重複使用次數，降低使用成本；使免疫親和色譜從單純的樣品前處理向在線分析方向發展；將多種抗體或簇特異性抗體固定於固相基質，製備多配體或簇特異性免疫親和色譜柱，對多種目標分析組分同時進行分離富集，使單組分免疫親和色譜技術向多組分免疫親和色譜技術發展。

二、分子印跡技術

(一)分子印跡技術原理

分子印跡技術(molecular imprinting technique，MIT)是以在空間結構和結合位點上與目標分析物相匹配、對目標分析物具有選擇性可逆結合能力的高分子聚合物為受體(也被稱為人工合成抗體)的分離分析技術。

建立農藥分子印跡技術的基礎是製備對目標分析農藥具有選擇性可逆結合能力的分子印跡聚合物。以目標分析農藥分子為模版，設計、合成或選擇與目標分析農藥在分子結構、分子問作用力等方麵相匹配的功能單體[如甲基丙烯酸(methylacrylic acid，MAA)、4-MAA)、乙烯基安息香酸等]，將功能單體與模版分子在適當溶劑中結合形成複合物(如甲基丙烯酸與氯三嗪、4-乙烯基吡啶與2，4-滴、4-乙烯基吡啶與吲哚乙酸、三氟甲基丙烯酸與甲磺隆、乙烯基安息香酸與有機磷農藥的複合物等)，然後選擇適當的交聯劑[如二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA)、季戊四醇三丙烯酸酯等]，在適當引發劑[如偶氮二異丁腈(azobisisobtltylnitrile，AIBN)等]引發下將功能單體相互交聯起來，使功能單體與模板分子相匹配的功能基團和空間結構得以固定，形成穩定的分子印跡聚合物。最後采用強極性溶劑多次萃取、索氏提取器反複回流萃取等方法，將聚合物中的模板分子脫除，這樣就在聚合物上留下了和模板分子在空間結構和結合位點相匹配的三維空穴，這樣的空穴能夠重新選擇性地與模板分子結合。

(二)分子印跡技術的應用現狀和特點

目前，分子印跡技術在農藥殘留分析中主要用於複雜樣品中目標分析農藥的分離、富集與淨化。用針對目標分析農藥的分子印跡聚合物製備固相萃取柱，將提取液過柱，樣品中的目標分析農藥被選擇性地保留在聚合物的空穴中，然後用少量洗脫劑洗脫目標分析農藥，達到選擇性分離、富集和淨化的目的。從柱中洗脫的目標分析農藥可采用不同方法進行檢測，實現對複雜樣品中痕量目標分析農藥的高靈敏度分析。也有少量應用分子印跡聚合物聚合物柱進行在線色譜分離分析的報道。

分子印跡聚合物是人工合成的，具有一定的選擇性識別能力和與高分子物質同樣的抗腐蝕、耐高溫、耐有機溶劑等優點，因而可應用於生物工程、臨床醫學、環境監測、食品工業等眾多領域，克服了天然抗體的局限性，在農藥殘留分析、特別是脂溶性農藥殘留分析中具有明顯的優勢。已報道的農藥分子印跡技術研究主要集中於三嗪類除草劑，其他還有2，4-滴、甲磺隆、吲哚乙酸和少數有機磷殺蟲劑。

分子印跡技術目前存在的主要問題是，現有分子印跡聚合物的三維空穴與模板分子在空間結構和結合位點的契合上還遠達不到抗原抗體結合的精密程度。因此分子印跡聚合物對目標分析物的識別能力還遠達不到抗體對抗原的特異性識別水平。分子印跡聚合物對非目標分析物的非特異性吸附也是困擾分子印跡技術應用的主要問題之一。

分子印跡技術的核心是分子印跡聚合物的製備。設計研製能夠與模板分子精密匹配的功能單體、研究製備自身不產生非特異性吸附的高效交聯劑、優化分子印跡聚合物製備技術、消除分子印跡聚合物的非特異性吸附是解決分子印跡技術現存問題的關鍵。

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相關鏈接：苯基脲類，咪唑啉酮類，吲哚乙酸，甲磺隆