圖6顯示了枯草芽孢杆菌GX2的芽孢發酵曲線，同時給出了活菌數和芽孢率隨發酵時問的堆肥變化情況。可見，用枯芽孢优化隨著發酵時問的草芽X产延長，活菌和芽孢濃度和芽孢率均呈先增加後降低的孢杆變化趨勢，發酵至10h和11h時，工艺活菌和芽孢濃度達最大，好氧分別為1.1×1010，堆肥和7.2×109CFu/mL，用枯芽孢优化此時，草芽X产芽孢率也達最大，孢杆為66.6％。工艺此後，好氧活菌數開始下降，堆肥芽孢數也相應降低，用枯芽孢优化說明發酵過程進入衰亡期。在這個基礎上，發酵至9h時改變發酵條件，開展後續產芽孢條件優化研究。
芽孢是產芽孢細菌在生長過程中形成的一種抗逆休眠體，因其具有耐熱、抗輻射、耐酸堿及抗化學藥物等特殊性質，可有效抵抗外界環境條件的變化，提高存活率，優化芽孢形成條件對微生物菌劑的製備具有一定的實踐價值。與菌體的生長繁殖相似，芽孢的形成同樣受營養物質及環境條件等多因素的影響，在分批補料發酵培養提高細胞濃度的基礎上，對影響枯草芽孢杆菌GX2產芽孢的關鍵環境條件進行優化，進一步提高芽孢數及芽孢率，可為提高好氧堆肥用微生物菌劑的品質及其實際應用效果奠定技術基礎。
培養溫度是影響微生物生長繁殖和芽孢形成的重要環境條件之一，它主要通過影響細胞內生物大分子酶和蛋白質的合成與活性來促進芽孢形成。作者在搖瓶實驗優化的最佳培養基條件下進行培養，並采用分批補料技術，使得細胞濃度在培養9h時達到最大，然後調整培養溫度，研究溫度對芽孢杆菌GX2芽孢率的影響，結果如圖7所示。可見，培養溫度可在一定程度上影響微生物的生長繁殖及芽孢的形成，隨溫度升高，活菌及芽孢濃度均呈大致增加的趨勢，而芽孢率先升高後降低。當培養溫度為35℃時，活菌和芽孢濃度均較低，分別為9.2×109、5.5×109CFU/mL，芽孢率為59.8％。此後，隨著培養溫度升高，活菌濃度和芽孢數逐步提高，50℃時，芽孢數和芽孢率均最大，分別為7.55×10，CFU/mL和70.6％。當溫度進一步升高至55℃時，盡管活菌數和芽孢數略有升高，但芽孢率開始下降，因此，後續產芽孢研究的培養溫度采用50℃。
好氧堆肥用枯草芽孢杆菌GX2為好氧菌，氧氣是其生長繁殖和芽孢生成的重要影響因素。同時，溶解氧對發酵生產的穩定性和生產成本也具有較大影響。發酵罐培養時，發酵液中的溶解氧與通氣量和攪拌轉速有關，當通氣量一定時，可通過調整攪拌轉速改變發酵液中的溶解氧濃度，進而優化發酵及產芽孢過程。攪拌轉速對枯草芽孢杆菌GX2產芽孢的影響如圖8所示。可見，隨攪拌轉速的升高，活菌濃度不斷下降，而芽孢濃度和芽孢率卻呈先升高後降低的變化趨勢。由於發酵液中的細胞(活菌)濃度較高，約1.2×1010CFU/mL，較高的攪拌轉速帶來較大的剪切力，不利於細胞存活，因此，隨攪拌轉速升高活菌數不斷下降，這與文獻報道一致。同時，隨攪拌轉速升高，較高的剪切力使得更多營養細胞轉化為芽孢，當攪拌轉速為100r/min時，芽孢濃度和芽孢率均最大，分別為9.7×109CFU/mL和82.9％，進一步提高攪拌轉速，芽孢率開始下降，這與較高轉速下活菌數較低有關。
不同微生物菌株適宜的pH條件不同，酸堿度影響微生物細胞膜的通透性、膜結構的穩定性以及物質的溶解性或電離性，致使微生物對營養物質的吸收和利用呈現差異，進而影響微生物的生長繁殖，並對芽孢杆菌的芽孢率產生影響。由圖9可知，隨DH升高，活菌數、芽孢數和芽孢率均呈先升高後降低的變化趨勢。當pH為6.8時，活菌濃度最大，為1.25×1010CFU/mL。當pH升高至7.3時，盡管活菌數開始降低，但芽孢濃度和芽孢率達最大，分別為9.7×109CFU/mL和82.9％。進一步升高pH，活菌數、芽孢濃度以及芽孢率均明顯降低。
正交試驗是考察關鍵影響因素綜合效應及進行多條件優化的研究方法之一。這裏，在單因素優化的基礎上，以培養溫度、攪拌轉速和pH為關鍵影響因素，選用正交表進3因素3水平的正交試驗研究，以活菌數和芽孢數為評價指標，研究關鍵影響因素對芽孢杆菌GX2產芽孢的綜合效應，因素水平設計如表1所示，實驗方案設計及結果如表2所示，正交試驗極差分析結果如表3所示。結果表明，3個影響因素對活菌數的影響主次順序為pH＞攪拌轉速＞培養溫度，由均值κ得出最優組合為A2B2C2，即pH為7.3，培養溫度為45℃，攪拌轉速為100r/min。從芽孢率角度，3個影響因素的主次順序與活菌數相似，但其最優組合不同，為A1B3C3，即pH為6.8，培養溫度為50℃，攪拌轉速為150r/min。
較高的活菌數是提高芽孢率的前提，因此，從優化菌株生產性能，提高芽孢率的角度，選擇枯草芽孢杆菌GX2的活菌數和芽孢數均較高的培養條件和方案，確定最優方案為A1B3C3，即pH為6.8，培養溫度為50℃，攪拌轉速為150r/min，在此條件下進行3L發酵罐試驗驗證，結果表明，活菌數可達1.57×1010CFU/mL，芽孢數達1.32×1010CFU/mL，芽孢率為84.1％。與單因素優化相比，正交試驗優化可進一步提高芽孢杆菌GX2的芽孢率，是其工業化生產應用的重要參考。
好氧堆肥過程中添加微生物菌劑已成為促進堆肥腐熟、縮短堆肥周期的重要方法之一。微生物菌劑的作用效果與活菌數密切相關，隨著保存時間的延長，活菌數逐漸減少，影響堆肥效果。芽孢杆菌因其具有較強的抗逆性，能耐熱、酸、堿等不良環境，有利於微生物菌劑活性的保持，提高產品質量及應用效果。Huo等通過研究多粘芽孢杆菌孢子和營養細胞在生物有機肥貯藏過程中的活性，發現純孢子可提高儲存期問的存活率和孢子形成。優化芽孢杆菌的產芽孢條件，促進更多營養細胞轉化為芽孢。
培養條件優化是產芽孢條件優化的重要前提。作者以實驗室保存的堆肥用枯草芽孢杆菌GX2為研究對象，首先進行了搖瓶培養條件及培養基優化，在此基礎上，采用分批補料策略在3L發酵罐上進行發酵培養，所得發酵液的0D值和營養細胞濃度可達2.250和1.8×1010CFU/mL。汪晶晶等通過對澱粉芽孢杆菌的培養基及條件優化，發現菌體生長量有明顯提高，A600nm由1.228增加至1.6727。
目前，關於芽孢杆菌芽孢率的優化研究多是在搖床上完成的，郭曉軍等對堆肥用產蛋白酶的產芽孢條件進行了優化，芽孢率達95％。劉虎軍等對枯草芽孢杆菌進行了DH和溫度的產芽孢條件優化，生物量和芽孢數分別為5.7×1010、5.2×1010CFU/mL，芽孢率達91％。為實現工業化應用，發酵罐規模的產芽孢條件優化更具參考價值，為此，作者在搖瓶培養條件優化的基礎上，結合分批補料發酵技術，在3L發酵罐上進行了產芽孢條件優化，經單因素及正交試驗研究，獲得了堆肥用枯草芽孢杆菌CX2的最佳產芽孢條件，即pH為6.8，培養溫度為50℃，攪拌轉速為150r/min，此時，芽孢濃度為1.32×1010CFU/mL，芽孢率為84.1％，研究結果可為芽孢杆菌在微生物菌劑中的工業化應用提供重要參考。
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