非脫羧勒克菌（Leclercia adcarboxglata）是两个勒克粒耐一種廣泛存在於自然界中的腸杆菌科革蘭陰性兼性厭氧菌，與大腸杆菌有許多相同的自非R质制研生化特征，能引起免疫功能不全或有慢性疾病患者的脱羧感染，是菌的究多種微生物感染的病原體之一，與其他細菌共同引起較為嚴重的药机共感染。該菌是两个勒克粒耐一種機會致病菌且與誘發因素有關，如創傷或免疫抑製等，自非R质制研可從血液、脱羧糞便、菌的究痰、药机尿、两个勒克粒耐腹膜液和膿液中分離獲得。自非R质制研
β‑內酰胺類抗生素在過去70年被廣泛作為抗菌藥物，脱羧其耐藥現象可由多種機製引起，菌的究如產β‑內酰胺酶、药机主動外排係統、生物被膜機製、膜孔蛋白缺失以及與青黴素結合蛋白親和力下降等，其中β‑內酰胺酶水解或修飾β‑內酰胺類抗生素使其失活，使相應菌株對幾乎所有β‑內酰胺類抗生素產生耐藥性，質粒攜帶β‑內酰胺耐藥基因是導致菌株耐藥性快速傳播的主要原因。非脫羧勒克菌對頭孢菌素、碳青黴烯類、四環素類、氨基糖苷類、喹諾酮類和氯黴素敏感，近年來陸續報道了少量產超廣譜β‑內酰胺酶（extended‑spectrumβ‑lactamases,ESBL)和碳青黴烯酶的非脫羧勒克菌感染相關病例。現階段隻有少量多藥耐藥（multi‑drug resistant,MDR）的非脫羧勒克菌被報道，關於blaCTX‑M的報道僅有2例。
本研究中，我們對來源於原南京軍區總醫院重症急性胰腺炎患者血液樣本的菌株150707804和重慶醫科大學附屬第一醫院胃癌患者胃引流樣本的菌株P12375進行了分析，旨在對其遺傳背景、耐藥表型進行鑒定，通過高通量全基因組序列測定分析，結合生物信息學研究，對其攜帶耐藥基因的移動元件和耐藥基因座位進行精細注釋，揭示非脫羧勒克菌多重耐藥的傳播機製。
菌株150707804分離自47歲男性重症急性胰腺炎患者血液樣本，菌株P12375分離自63歲男性胃癌患者引流液樣本。16S rDNA基因擴增初步確定菌種。
使用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析儀對菌株150707804、P12375分別進行藥敏MIC檢測，依據美國臨床與實驗室標準學會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2020標準判讀結果[20]。
使用Qiagen公司的Ultra Clean®Microbial DNA Isolation kit(CAT.12224‑250）試劑盒，分別從分離株150707804和P12375中提取基因組DNA。構建均值約15 kb(10～20 kb）的DNA文庫，通過PacBio RSII測序平台進行“三代”高通量基因組測序。同時，構建均值約400 bp(150～600 bp）的雙端測序（paired‑end）文庫，利用HiSeq“二代”測序平台上機測序。通過Proovread[21]軟件用短雙端測序讀長（paired‑end reads）校正PacBio長reads，校正過的PacBio reads通過HGAP v3.0（基因組覆蓋率100×）進行拚接組裝，最終獲得野生株完整基因組全序。
以複製子repA正向序列起始密碼子的第一個堿基作為整個質粒的“+1”位點，首先采用RAST 2.0初步預測質粒的開放閱讀框（open reading frame,ORF），結合BLASTP/BLASTN、RefSeq數據庫和Conserved Domains數據庫進行ORF和假基因的逐個功能分析。利用在線數據庫ResFinder和CARD對耐藥基因進行注釋，ISfinder、INTEGRALL和Tn Number Registry分別對插入序列、整合子、轉座子等結構進行注釋。用Inkscape 1.0繪製質粒整體結構圖、質粒近源結構比較圖和耐藥基因座位精細結構比較圖。
兩株菌進行全基因組測序後，得到質粒p707804‑CTXM和pP12375‑CTXM序列，提交至Gen‑Bank，登錄號分別為MN823992和MN821366。
菌株150707804和P12375經16S rDNA擴增初步鑒定，全基因組DNA序列與非脫羧勒克菌USDA‑ARS‑USMARC‑60222（登錄號：NZ＿CP013990）進行平均核苷酸一致性（average nucleotide identity,ANI）比對，結果菌株150707804為98.66%、菌株P12375為98.72%，最終核定兩株菌均為非脫羧勒克菌。
野生株150707804對青黴素類、頭孢菌素類、碳青黴烯類、喹諾酮類、單環β‑內酰胺類及呋喃類抗生素耐藥，對氨基糖苷類和磺胺類抗生素敏感；野生株P12375對青黴素類、頭孢菌素類、碳青黴烯類、單環β‑內酰胺類及呋喃類抗生素耐藥，對氨基糖苷類、喹諾酮和磺胺類抗生素敏感（表1），其中，喹諾酮類和呋喃類耐藥表型不同，可能原因：(1)喹諾酮類抗生素的主要作用靶點為DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，使細菌DNA不能形成超螺旋。質粒p707804‑CTXM和pP12375‑CTXM無喹諾酮類耐藥基因，其對應染色體上也不含有耐藥基因，但菌株150707804和P12375的其他質粒中分別含有qnrA、aac(6′）Ib-cr和qnrS、aac(6')Ib-cr。P12375對喹諾酮類抗生素敏感可能是由於耐藥基因突變不表達所致；(2)呋喃類抗生素主要由對氧不敏感的硝基還原酶基因（nfsA和nfsB）突變失活引起，幹擾氧化還原酶從而阻斷細菌的正常糖代謝。質粒p707804‑CTXM和pP12375‑CTXM不含呋喃類耐藥基因，且菌株150707804和P12375的其他質粒及染色體上也不含該類耐藥基因，可能是由於外排泵等其他耐藥機製引起表型差異，並不屬於本研究的範圍。
2.3.1質粒p707804‑CTXM和pP12375‑CTXM的基本特征
p707804‑CTXM和pP12375‑CTXM大小分別為110.2和116.7 kb（圖1，表2）。兩個質粒全序高度相似（覆蓋度75%、核苷酸同源性98.69%），均包含保守骨架區（覆蓋度85%、核苷酸同源性98.69%）和外源插入區。
質粒p707804‑CTXM和pP12375‑CTXM骨架區總長度分別為84.3和85.8 kb（圖2）。二者均由質粒複製相關區（plasmid replication）、質粒穩定相關區（plasmid maintenance）以及質粒接合轉移相關區（conjugal transfer）組成。兩個質粒有一定保守性，它們含有相同的複製子repA，為同一類型質粒；含相同的質粒穩定相關基因parA、stbAB等；接合轉移區均含tra和pil兩個基因簇。同時，這兩個質粒也存在差異性：(1)pP12375‑CTXM中orf531被MDR區分割為兩部分，而在p707804‑CTXM中orf531完整；(2)兩質粒orf531至parA間差異性較大，有大片段的序列置換；(3)p707804‑CTXM的orf516與pP12375‑CTXM的orf927存在基因置換；(4)接合轉移區內p707804‑CTXM的orf774、orf234與pP12375‑CTXM的orf1890存在基因置換。
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