以提取的枯草芽孢杆菌S7基因組為模板，根據飛行質譜結果獲得的降解菌种及植物過氧化氫酶基因序列設計引物(見表2)，PCR擴增從而獲取目的牛奶基因片段。隨後將載體pET-24a(+)與PCR產物分別與相對應的原蛋验证限製性內切酶混合，在37℃下孵育1.5h，白酶兩者酶切產物經過膠回收純化後用DNA連接酶連接，筛选在16℃下連接6～8h，重组植物連接產物通過熱激法轉化E.coliDH5α感受態細胞，化氢在LB卡那黴素抗性平板上挑取陽性克隆子，高效过敏过氧功菌落PCR驗證後提取質粒，降解菌种及經過測序鑒定，牛奶最終獲得含有目的原蛋验证基因的重組質粒pET-24a(+)/katA。將質粒pET-24a(+)/katA轉化E.ColiBL21(DE3)感受態細胞，白酶最終獲得重組植物過氧化氫酶表達菌株。筛选
純化過程全部在4℃下進行，將離心收集的重組菌充分倒入培養基。將菌體重懸於25mL緩衝液A(200mmol/LTris-HCl(pH7.4)，500mmol/LNaCl，5mmol/Lβ-mercaptoe-than01)中，使用BransonSonmer450對細胞進行了超聲破壁處理，高速離心後收集破碎液上清液。再采用AKTAStart(GEHealthcare)和HisTraD親和柱對目標蛋白質進行純化，在經緩衝液A平衡後接入上清液，先使用含5mmol/L咪唑的緩衝液A進行清洗後，使用含300mmol/L咪唑的緩衝液A進行洗脫，獲得重組植物過氧化氫酶。
水解產物經過超濾、脫鹽等預處理後，直接加載到反相預柱(AcclaimPepMapRSLC)進行肽段分離，分離後肽段經QExactiveP1us混合四極軌道質譜儀分析，收集的串聯質譜結果上傳至mascot搜索引擎進行分析，比對後獲得對應的肽段序列。
將篩選獲得的野生菌進行16SrRNA和功能基因gyrA鑒定，以確定各個野生菌的種屬，再分別進行發酵培養，獲得其發酵液上清液。由於不同野生菌蛋白酶表達量不同，無法直接使用發酵液上清液進行橫向比較。而0PA法可檢測整個體係水解程度，ELISA可以檢測水解反應體係中針對某一特定底物的水解程度，利用此特點設計實驗，首先通過0PA法確定各個發酵液的酶活，再分別稀釋，使其針對整體底物脫脂奶粉的酶活達到相同水平。此後，將調整濃度後的發酵液對脫脂奶粉進行水解反應，並通過ELISA分析對底物αs1酪蛋白的酶活。如此可篩選出對混合底物脫脂奶粉的酶活相同時，對過敏原αs1酪蛋白選擇性更高的蛋白酶產生菌。如圖2所示，橫坐標為各個野生菌的種屬名和篩選編號，縱坐標為調整後發酵液上清液的水解叱，酪蛋白酶活。其中酶活最高的為枯草芽孢杆菌S7發酵液上清液，而作為對照的商業酶A-2SD和NY-10酶活較低。在總酶活調整一致的情況下，其他野生菌針對過敏原酶活水平不高，如嗜麥芽寡養單胞菌S2、綠膿假單胞菌S8(非食品安全菌)，故選擇枯草芽孢杆菌S7為去除過敏原的主要研究對象，並進行菌種保藏(CCTCCN0.M2016532)。同時被鑒定為枯草芽孢杆菌的還有S21和S23，值得關注的是S21和S23酶活水平接近，但與S7有顯著差異。
通過比對S7和S21的發酵液上清液進行SDS-PAGE分析發現,枯草芽孢杆菌S7在5.5×104位置分泌的一種蛋白質在S21發酵液中分泌量極少。此後使用MALDI-TOF/T0F對各個條帶進行肽指紋圖譜分析，如圖3所示，以3.2×104的鞭毛蛋白(uniProtKB：P02968，含量最高條帶)作為對比參照，主要蛋白酶為2.8×104的枯草芽孢杆菌蛋白酶E(UniProtKB：P04189)，而表達量差異最大是5.5×104的植物過氧化氫酶(UniProtKB：P26901)。
通過從枯草芽孢杆菌S7中調取植物過氧化氫酶基因，並構建重組表達質粒，獲得異源表達菌株。再通過誘導表達和鎳柱親和層析法，獲得了重組植物過氧化氫酶。如圖4中SDS-PAGE所示，泳道1為鎳柱純化流穿峰，泳道2為5mmol/L咪唑洗脫峰，泳道3為300mmol/L咪唑洗脫峰，在5.5×104左右可見明顯條帶，證明獲得可融性表達的重組酶。
通過將純化後的重組植物過氧化氫酶回補至S21發酵液上清液巾，S21水解αs1酪蛋白的酶活從75.43U/L提升至106.18U/L達到與S7的119.43U/L相近水平，從而證明了S7和S21的酶活差異主要是由植物過氧化氫酶的表達量差異導致的。據此，我們發現植物過氧化氫酶不僅可以水解過氧化氫，維持更好的還原環境，協助枯草芽孢杆菌蛋白酶E抵抗氧化應激，保護其結構不被自由基破壞，增加蛋白酶作用時間；可能還具有破壞蛋白膠粒中的二硫鍵，將其中的過敏原αs1酪蛋白釋放出來，使蛋白酶可以更高效地進行水解反應，增強蛋白酶的選擇性脫敏效果(見圖5)。
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