一、高效高效液相色譜法概述

高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatogra：phy，液相HPLC）是色谱20世紀60年代末期，在經典液相柱色譜的高效基礎上，引入了氣相色譜的液相理論和技術，並加以改進而發展起來的色谱新型高效分離分析技術。它是高效指流動相為液體的色譜技術，采用高壓泵、液相小顆粒高效固定相和高靈敏度檢測器，色谱實現了分析速度快、高效分離效率高和操作自動化。液相高壓是色谱高效液相色譜法的突出特點，係統內壓力可達15～35MPa。高效由於流動相流經色譜柱時，液相柱內填料細密，色谱受到阻力很大，為使流動相攜帶組分迅速通過色譜柱，進入檢測室，就必須對流動相施以高壓。由於化學鍵合固定相的出現，使高效液相色譜柱效能、分離效率大大提高。

高效液相色譜法是農藥殘留分析不可缺少的手段。高效液相色譜儀也是農藥殘留分析實驗室必備的儀器設備之一。它解決了熱穩定性差、難於氣化、極性強的農藥殘留分析問題，隨著高靈敏、通用型檢測器的成功開發及應用，能勝任絕大多數農藥殘留分析任務。

（一）高效液相色譜法的特點

1、高效：由於使用了細粒度的高效填充柱和均勻填充技術，高效液相色譜法分離效率極高，柱效能一般可達每米10“理論塔板數。商品化的還有微型填充柱（內徑為lmm）和毛細管液相色譜柱（內徑為0．05mm），柱效能超過了每米10。理論塔板數，能夠實現極為有效的分離。

2、高速：由於使用高壓泵輸送流動相、采用梯度洗脫裝置、用檢測器在柱後直接檢測

洗出液成分等原因，高效液相色譜法完成分離分析的時間隻需幾分鍾到幾十分鍾，比經典液相色譜法要快得多。

3、高靈敏度：紫外線、熒光、電化學、質譜等高靈敏度檢測器的使用，使其靈敏度與氣相色譜（GC）相接近。

4、高度自動化：先進的高效液相色譜儀配有計算機，不僅能夠自動處理數據、打印分析結果，而且能夠對儀器的全部操作包括流動相、流速、柱溫、檢測器波長的選擇，以及進樣、梯度洗脫方式等進行程序控製，成為全自動化的儀器設備。

5、不受分析試樣揮發性和相對分子質量的限製：可用於分離高沸點、相對分子質量大、熱穩定性差的農藥殘留及其代謝物的檢測。

一般來講，高效液相色譜法的不足是比氣相色譜法分析成本高（流動相、光源燈、色譜柱的消耗）、故障率高，工效也稍低。

（二）高效液相色譜法的基本類型

液相色譜法主要分為2種類型：平麵色譜（薄層色譜、紙色譜）和柱色譜。柱色譜可分為經典柱色譜（低壓）和高效液相色譜（高壓）。高效液相色譜法又可分為液固吸附色譜法（1iquidsolidadsrptionchromatogtaphy，LSC）、液液分配色譜法（1iquid-liquidpartitionchromatography，LLC）【主要是鍵合相色譜法（bonded-phasechromatography，BPC）】、離子交換色譜法（ion-excharlgechromatogry，IEC）、空間排阻色譜法（spatialexclLlSlOnchromatography，SEC）。與經典的柱色譜法不同，高效液相色譜法采用高壓泵、填充微粒固定相的短柱，並且隨著組分的流出檢測器產生信號並記錄下來。高效液相色譜法原理與經典的柱色譜法相同，它的進步主要依賴於色譜儀硬件的開發。高壓泵能保證當壓力不斷升高的情況下，流量的精度沒有變化，同時有大量的各種類型和規格的色譜柱供選用。

高效液相色譜法分離模式可分為4種基本形式。建立農藥殘留分析的高效液相色譜方法，選用哪種分離模式取決於農藥的化學分子結構、性質以及對樣品中所含有的幹擾物質的分離。一般地，高效液相色譜法分析測定農藥殘留量以液液分配色譜的鍵合相色譜法最為常用。根據固定相和流動相相對極性有2種操作方式，一種是正相色譜法（normal—phasechromatography，NPC），另一種是反相色譜法（reverse—phasechromatogra—phv，RPC）。正相色譜法的固定相極性比流動相大，非極性組分先流出色譜柱；隨著流動相極性的提高，被分析的組分保留時間縮短。正相色譜法的優點是調節分離選擇性時溶劑選擇範圍寬，由於經常使用低黏度溶劑，柱壓低，可得到更好的譜圖；其缺點是在某些情況下，流動相配比比例懸殊，平衡時問較長，重現性差，流動相中低濃度的極性汙染物會影響分析的靈敏度。

反相色譜法的固定相極性比流動相小。絕大多數極性組分先流出，隨著流動相極性的增加，被分析的組分保留時間延長。反相高效液相色譜法是農藥殘留分析最常用的一種操作方式。

1、液固吸附色譜法：液固吸附色譜法的流動相為液體，固定相為吸附劑。固定相（常用矽膠）通常為沒有包裹固定液的液相色譜法。樣品中各組分因對固定相表麵吸附作用的差異，得以分離和分析。色譜柱內充填固體吸附劑，利用吸附劑表麵活性中心進行吸附，試樣不進入固定相內部。流動相帶著被測組分進入色譜柱時，吸附劑不僅對不同的組分具有不同的吸附力，而且對流動相分子也具有一定的吸附作用，在吸附劑表麵各組分分子之間及各組分分子與流動相分子之間發生吸附競爭，保留值由這兩個因素決定。

液固吸附色譜法的特點：適合可溶於有機溶劑的非離子型化合物的分離，特別是異構體及具有不同極性的取代基的化合物分離；適合於分析非極性和中性化合物，極性化合物可能在色譜柱上產生不可逆的吸附；分析結果重複性差，柱穩定性不好；樣品組分吸附在吸附劑的活性部位有變質和損失的可能。這種方法在農藥殘留分析上較少應用。

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