2 結果與討論

2.1 COS的酶法酶法製備

考察酶解時問、加酶量對殼聚糖酶酶解的制备肿瘤影響。如圖1所示，壳寡還原糖生成量隨酶解時問延長而上升。糖及酶解4h內，其抗還原糖含量快速增加，活性4h之後趨於平穩，酶法最佳酶解時問選定4h。制备肿瘤南圖2可知，壳寡酶解過程中，糖及還原糖生成量隨著加酶量的其抗升高而逐漸增大。在加酶量為120U/g時，活性還原糖生成量近最大值後穩定。酶法繼續增加酶量未能使還原糖質量濃度顯著增加。制备肿瘤最優加酶量選擇為120U/g。壳寡

對酶解液逐步采用乙醇沉澱、超濾、納濾進行分級分離，工藝流程如圖3，最終得到COS產物，得率約41％。

2.2 COS組成分析

采用LC-MS法分析COS產物組成。液相色譜圖中對應3個保留時問有吸收峰(見圖4(a))，分別是5.21、6.90、8.36min。分別對其進行質譜分析，在ESI⁺模式下，質荷比m/z341.1、363.1(見圖4(b))對應[殼二糖+H]⁺、[殼二糖+Nal⁺的分子離子峰，502.2、524.2(見圖4(c))對應[殼三糖+H]⁺、[殼三糖+Nal⁺的分子離子峰，663.3、685.3(見圖4(d))對應[殼四糖+Hl⁺、[殼四糖+Na]⁺的分子離子峰。依此判斷所得COS產物的主要組分為殼二糖、殼三糖和殼四糖。進一步通過峰麵積積分計算可知.所得COS組分中殼二糖、殼三糖和殼四糖相對含量的比例約為3:5:2。

通過自行構建的殼聚糖酶酶解，以及多級分級處理工藝獲得了低相對分子質量的COS，為後續抗腫瘤活性的分析提供了更為明確和簡單的物質基礎。

2.3 COS抗腫瘤作用評價

2.3.1 COS對不同腫瘤細胞的抑製活性

研究COS對人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MDA-MB-231和人胰腺癌細胞PATU-899生長的影響(見圖5)。在給藥質量濃度0～1000μg/mL情況下，未觀察到3株腫瘤細胞有生長抑製現象，可以認為低質量濃度的COS對腫瘤細胞生長影響甚微。

類似的結果在前期A549和HCT-116細胞的研究中也有報道。4種來源不同的COS作用時，高質量濃度(1.25～20mg/mL)明顯抑製細胞增長，而低質量濃度(0.078125～1.25mg/mL)呈現負抑製作用。

其中相對分子質量在1500～2000的COS樣品即使在高質量濃度(1.25～20mg/mL)下對A549細胞依然無細胞毒性。綜觀已報道的研究結果，多數報道可顯著抑製細胞生長的研究巾使用的COS質量濃度較高，如相對分子質量1000～3000的COS在質量濃度5.0mg/mL時對MDA-MB-231細胞抑製效果最佳；2～5mg/mL的COS對HepG2細胞抑製率有劑量依賴關係。COS的腫瘤抑製活性因自身相對分子質量、給藥質量濃度以及評價用細胞株的不同而各異，因此有必要進行更為細致地考察和分析。

2.3.2 COS聯合DOX對不同癌細胞的抑製活性

近期研究發現，在多株骨肉瘤細胞巾，甘露糖與DOX或順鉑聯，用可通過下調Bcl-2家族的Mcl-1和Bcl-X_L蛋白質表達水平而增強腫瘤細胞內在凋亡途徑，提高抗腫瘤作用。DOX是治療乳腺癌、肝癌等實體瘤的一種常用化療藥物。DOX的非靶向性可對正常細胞造成損傷。因此，新的方案建議可與其他藥物或天然產物聯用降低用藥量以減少其副作用。受此啟示，將COS與DOX複合給藥以評價其效果。如圖6所示，相較於DOX組50％的細胞生存率，COS僅在人乳腺癌細胞MDA-MB-231上表現出增強DOX抑製作用的效果，且在較低質量濃度下細胞生存率可下降20％～30％。由此選定MDA-MB-231細胞為後續實驗的模型，進一步探討複合給藥的效果和機製。
 

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