1.2.6 OGE的硬脂燕麦臨界聚集濃度

臨界聚集濃度的測定利用熒光探針法，方法參照文獻並稍作修改。酸修饰的束準備稱取芘標準品配製濃度為3×10^-4mol/L的多糖芘甲醇溶液。取10mL的自聚制备具塞試管，每管中加入3×10^-4mol/L的集胶及芘甲醇溶液20μL後，用氮氣將溶液中的特性甲醇吹幹。選取不同取代度的初探OGE，再向每管中加入10mL不同取代度、硬脂燕麦不同濃度（0.0002～3mg/mL）的酸修饰的束OGE溶液，此時芘的多糖最終濃度為6×10^-7mol/L，室溫下避光高速攪拌5h後，自聚制备利用熒光分光光度計測定芘的集胶及發射光譜。測定條件：激發波長330nm，特性發射和激發狹縫均為5nm，初探發射光譜的硬脂燕麦掃描範圍350～500nm。記錄I₁（374nm）和I₃（385nm）處的熒光強度。以OGE濃度的對數為橫坐標，I₁/I₃的值為縱坐標繪製散點圖，並進行曲線擬合後，求兩擬合曲線交點處的橫坐標，換算成濃度，此時的濃度即臨界聚集濃度。

1.2.7 OGE的溶解度

稱取一定取代度的OGE，配製成2.0mg/mL的溶液，將溶液於100℃下加熱15min後取出，離心20min（3000×g），收集上清液烘幹稱重，並記錄，按式（2）計算其溶解度。

1.2.8 OGE的細胞毒性分析

從液氮罐中取出裝有Raw264.7細胞的凍存管1支，37℃水浴複蘇、傳代、定期換液等工作。試驗開始前加入新鮮DMEM高糖培養基（含10%FBS）製成細胞懸液，1000×g離心5min後，棄上清後，加入新鮮培養液，懸浮細胞計數。將細胞濃度調成3×10⁴個/孔的密度，以100μL/孔接種於96孔細胞培養板中。置於37℃，5%CO₂培養箱中過夜，使細胞充分貼壁，棄上清後，以100μL/孔加入不同濃度（25，50，100，200μg/mL）的OGE溶液至各孔中，每組設置6個重複孔。在37℃，5%CO₂培養箱中培養24h後，加入10μLCCK-8液，再放入細胞培養箱中培養2h左右，在波長450nm處測定吸光值（OD值）。

式中，A₁—試驗孔吸光值（OD值）；A₂—對照空吸光值（OD值）；A₀—空白孔吸光值（OD值）。

1.2.9 數據處理

本試驗各數據采用“平均值±標準偏差”表示。利用MestReNova軟件進行NMR圖譜數據處理，SPSSStatistics24統計學軟件進行正交試驗設計及結果分析，采用單因素方差分析進行各組間指標差異比較，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 燕麥β-葡聚糖硬脂酸酯（OGE）的製備

2.1.1 硬脂酸活化液添加量對取代度的影響

有報道稱，脂肪酸酯化多糖的反應是可逆的。因此，硬脂酸酰基咪唑的增加促使該酯化反應向正方向不斷進行。從圖1可以清晰地看出，隨著硬脂酸酰基咪唑添加量不斷增加，產物取代度也不斷增加。推測由於隨著硬脂酸酰基咪唑添加量的增加，燕麥β-葡聚糖與酰基咪唑之間的碰撞頻率也隨之不斷增大，使得整個體係中的酯化效率相應提高。繼續添加硬脂酸酰基咪唑時，硬脂酸酰基咪唑與燕麥β-葡聚糖中的羥基基團發生的反應也慢慢趨於飽和，反應速率減緩，取代度的增加趨勢也變得較為緩慢。
 

2.1.2 反應溫度對取代度的影響

圖2是酯化反應溫度對產物取代度的變化圖，其中，當反應體係的溫度從70℃升至80℃時，酯化產物的取代度從0.036增加至0.057後，繼續升高體係的反應溫度，對酯化反應的影響不是很大，取代度數值變化較小，並趨於平緩。可能由於溫度升高，大分子鏈的活性也相應增強，促使反應體係中分子間的有效碰撞次數增加，取代度隨之發生變化。當反應體係中參與反應的分子達到飽和時，有效碰撞的次數不再增加，取代度的變化也趨於穩定。

2.1.3 反應時間對取代度的影響

根據酯化反應的理論分析結果，酯化反應會隨著時間的延長逐漸達到一個極限值。如圖3所示，隨著酯化反應時間的持續延長，取代度相應升高，燕麥β-葡聚糖的酯化反應也越充分。酯化反應在4.5h前，由於體係中生成的OGE濃度較低，使得體係中的酯化反應能夠持續進行。而當整個體係在反應進行到5.0h時，產物的取代度增長幅度變得緩慢，此時反應體係中的酯化反應與分解反應即將平衡。因此，反應時間並不能無限延長下去。

2.1.4 OGE製備條件的優化

利用SPSSStatistics24軟件進行正交試驗設計，采用3因素3水平進一步研究硬脂酸活化液添加量（A）、反應溫度（B）和反應時間（C）對OGE取代度的影響，確定出OGE的最佳製備條件。

從表1中可以清楚的得到此反應中OGE的最佳製備條件，即當硬脂酸酰基咪唑添加量為6.50mL，反應溫度為90℃，反應時間為5.0h時，有最大取代度，為0.133。

2.2 OGE的外觀形態及粒徑

分別配製1mg/mL的燕麥多糖溶液和同質量濃度的OGE溶液作對比可以看出，OGE溶液更為渾濁，且上層有很多泡沫存在，而燕麥多糖溶液則清澈，且幾乎無泡沫存在。推測是由於在原燕麥β-葡聚糖中接入了硬脂酸，硬脂酸本身具備乳化、穩定及潤滑作用有可能也帶入到OGE中，使得OGE液體上方出現諸多泡沫。

據相關報道，兩親性多糖在較低濃度下能夠形成殼核結構的自聚集膠束，納米膠束的外觀形態大多呈球狀。如圖5所示，OGE在掃描電鏡下可以清晰地看出其外觀形態為球形，較原燕麥β-葡聚糖的粒徑更小，大小更為均一。原燕麥β葡聚糖有幹癟狀的球形，而經過改性後的兩親性多糖更加飽滿。

大多數兩親性多糖形成的膠束的PDＩ都非常窄。PDＩ值越小表示粒徑分布越窄，顆粒大小越均一。有研究表明，當PDＩ＞0.7時，代表顆粒的粒徑分布較寬。正如表2所示，OGE的PDＩ＜0.7，可認為OGE的粒徑大小較為均一，與掃描電鏡呈現的表觀形態一致。然而在不同取代度下，OGE的粒徑大小也存在差異，隨取代度的增加，OGE的粒徑大小反而降低。可能由於OGE本身形成的膠束體係中，不同取代度下的比表麵積和表麵能的差異，導致自發的粒子聚集程度不同所致。疏水改性後的多糖相比較原糖來說，即取代度為0時，粒徑更小，其PDＩ值也越小。

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