黑豆因其種皮呈黑色而得名，转谷營養豐富，氨酰胺酶具有高蛋白、催化低熱量的糖对黑豆蛋的影特性，其含有微量元素、基化維生素和大豆皂甙等多種功能因子，修饰响此外，白抗黑豆還具有美容、氧化防癌作用；殼寡糖是活性一種聚合度在2～20之間的寡糖，具有分子量低、转谷吸附效果好，氨酰胺酶水溶性好、催化易被人體吸收、糖对黑豆蛋的影生物活性高，基化調節腸道微生態、修饰响改善腸道組織形態和增強免疫功能等特點；蛋白質的糖基化修飾，是以共價鍵連接的方式將親水性的糖類物質導入蛋白質分子之中，使其既有蛋白質的分子特性，又有糖類物質的親水特性；研究表明，蛋白質糖基化修飾後表現出優越的乳化能力，其溶解性、膠凝性、流變學特性、抗氧化性、熱穩定性、抗菌性等功能特性也有所提高。蛋白質糖基化修飾後抗氧化性的研究較少；本文利用糖基化修飾技術，以殼寡糖和黑豆蛋白為研究對象，製備殼寡糖糖基化黑豆蛋白，探討其抗氧化性能的變化，為拓展糖基化蛋白改性和提供天然的抗氧化劑提供基本技術依據。
一、材料與方法
1、材料和試劑
黑豆，黑龍江地產青仁黑豆。DPPH(分析純)，美國Sigam公司；ABTS(AR級)，美國Sigam公司；水溶性維生素E(Trolox)，美國Sigam公司；殼寡糖，浙江金殼藥業有限公司；三氯化鐵(FeCl3)(分析純)，天津金匯太亞化學試劑有限公司；鐵氰化鉀(K3Fe(CN)4)(分析純)，天津光複精細化工研究院；三氯乙酸(分析純)，天津市大茂化學試劑廠，磷酸三鈉(Na3PO4)(分析純)，天津市長鑫宏翔商貿有限公司；鉬酸銨(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；亞硝酸鈉(分析純)，天津市鴻鑫化學試劑有限公司；對氨基苯磺酰胺(分析純)，天津光複精細化工研究院；鹽酸N-(1-萘基)-乙二胺(分析純)，天津光複精細化工研究院。
2、試驗儀器
DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋購白天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計購自瓦裏安科技有限公司；XS204電子分析天平購自上海精學科學有限公司；漩渦混合器購自江蘇同君儀器科技有限公司。
3、方法
（1）溶液配製
①DPPH工作液配置：精確稱量0.0123gDPPH，乙醇充分溶解並定容至50mL，作為DPPH工作液(0.39mM)。
②PBS緩衝液：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04，溶於800mL蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH至7.4，最後加蒸餾水定容至lL即可。高壓蒸汽滅菌20min，保存於室溫或4℃冰箱中。
③ABTS工作液配置：精確稱取0.192lgABTS標準品溶解於50mL蒸餾水中，製成7.0mol／L的ABTS水溶液。精確稱取0.3312g過硫酸鉀溶解於500mL蒸餾水中，製成2.45mmo/L過硫酸鉀水溶液。將50mLABTS水溶液與50mL過硫酸鉀水溶液混合，在室溫下避光放置12h～16h，形成ABTS自由基儲備液。準確吸取1.0mL加入40～50mL的無水乙醇，在734nm下吸光度為O.700±0.020得到ABTS工作液。
(2)黑豆蛋白的製備
①黑豆分離蛋白：黑豆蛋白分離提取的方法參照本研究前期試驗中經過優化的提取方案：400g黑豆豆粕粉，加水4L，用0.5mol／LNaoH調pH至8.5，50℃水浴攪拌1.5h，8000r/min離心10min取上清液，用0.5mol／L鹽酸調pH至4.5，8000r/min離心10min取下層固體，用pH為4.5的蒸餾水洗兩遍，8000r/min離心10min，取沉澱，用0.5mol／LNaOH調pH至7.0，冷凍幹燥(幹燥條件：幹燥架溫度-20℃，真空度0.5mbar)
②酶法糖基化黑豆蛋白：酶法糖基化黑豆蛋白的方法參照本實驗前期試驗中優化所得方案：取1.5g黑豆分離蛋白，加1.5g殼寡糖，1.0g轉穀氨酰胺酶和100mL蒸餾水，37℃水平振蕩反應4h，80℃水浴滅酶5min，冷卻至室溫後4℃透析除去未結合的殼寡糖，冷凍幹燥。
③自交聯黑豆蛋白：為對比不同改性方法下黑豆蛋白的抗氧化性，轉穀氨酰胺酶的加入比例同②，取1.5g黑豆分離蛋白，加1.0g轉穀氨酰胺酶和100mL蒸餾水，37℃水平振蕩反應4h，80℃水浴滅酶5min，冷卻至室溫後4℃透析除去未結合的殼寡糖，冷凍幹燥。
④濕熱法糖基化黑豆蛋白：為對比不同改性方法下黑豆蛋白的抗氧化性，殼寡糖的加入比例同②，取1.5g黑豆分離蛋白，加1.5g殼寡糖和100mL蒸餾水，90℃水浴4h，取出在25℃水浴5min，4℃透析除去未結合的殼寡糖，冷凍幹燥。
(3)DPPH自由基清除能力測定
本試驗中DPPH自由基清除能力測定在參考Sajga等的方法基礎上，稍作改動。吸取1mL待測液，加入2mLDPPH工作液充分搖勻，在室溫下避光30min，在517m處測定該液吸光度(Ai)，以無水乙醇作為空白，同時測定lmL試液與2mL無水乙醇的吸光度(Aj)及1mL無水乙醇和2mLDPPH工作液混合液的吸光度(Ac)，按下式計算DPPH的清除率(SA)。
（4）ABTS自由清除能力測定
參照唐豔平等的方法略作改動。吸取1.0mL待測液加入1.0mL的ABTS工作液，混勻。在室溫下避光10min，於波長734nm下測其吸光度(Ai)，無水乙醇作為空白，同時測定30μL試液和1.0mL無水乙醇混合液吸光度(Aj)及30μL無水乙醇和1.0mL的ABTS工作液混合液吸光度(Ac)，按下式計算ABTS自由基清除率(SA)。
（5）總還原能力的測定
本試驗中樣品總還原能力的測定在Oyaizu等的方法基礎上稍作調整。取測試樣品溶液0.5mL加入pH為6.6的磷酸鹽緩衝溶液和1％的K3Fe(CN)6溶液各2.5mL並混合均勻，於50℃放置20min，加入2.5mL蒸餾水和1.0mL0.1％的FeCl3混合均勻，靜止10min後於700nm下測定吸光度(用0.5mL的蒸餾水替換0.5mL樣品溶液其他條件不變作為調零溶液)。
（6）總抗氧化能力的測定
本試驗中總抗氧化能力的測定參照Benzuie和Strain的方法，略做改進。使用磷鉬絡合物法，又稱鉬藍法。總抗氧化能力測定原理：鉬酸銨會在硫酸與磷酸的作用下發生還原反應，產物呈現綠色，該物質在695nm處有最大吸收波長。抗氧化劑會和鉬會競爭發生還原反應，從而影響綠色產物的生成量。可以通過分光光度法通過測定吸光度來檢測鉬藍的產量，以此間接的反映出抗氧化劑的能力。吸光度值越高表明抗氧化劑的抗氧化能力越強。在具塞試管中依次加入1.0mL(3mol／L)H2S04溶液，1.0mL(0.14mol／L)Na3P04溶液和1.0mL(0.2mol／L)鉬酸銨溶液，再分別加入1.0mol以上樣品溶液，蒸餾水定容至5.0mL搖勻，加塞於95℃水溶液中加熱90min，取出冷卻至室溫後在695nm波長下測定吸光度。
（7）清除亞酸鹽能力的測定
本試驗中亞硝酸鹽清除能力的測定根據李佳穎等的方法，略作修改。準確吸取0.5mL樣品溶液於試管中，分別加入5μg，mL亞硝酸鈉溶液250μL，振蕩均勻，加pH3.0的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩衝液2.0mL，混勻後於37℃水浴30min。加入1mL濃度為0.4％對氨基苯磺酰胺和1mL濃度為0.2％鹽酸N-(1-萘基)-乙二胺，混勻並定容至刻度，靜置15min，於545nm波長測定其吸光度Ao。同用無水乙醇代替樣品其他條件不變，測得吸光值為氏；lmL濃度為0.2％鹽酸N-(1-萘基)-乙二胺換為1.0mL無水乙醇測定吸光值為A2。按下式計算清除率(SA)。
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