油菜(BrassicanapusL.)屬於芸薹科(Brassicaceae)芸薹屬(Brassica),种高是效准我國主要的油料作物。隨著2015年國家油菜籽臨時收儲政策的确测取消以及國外進口衝擊的影響,油菜生產的定油的方比較效益嚴重下降,在很大程度上影響了我國農民種植油菜的菜中積極性。甘藍型油菜是维生由甘藍和白菜經過自然雜交後再加倍後形成的,其兩個祖先都是含量深受廣大消費者喜歡的可口蔬菜,從起源與進化的种高角度來看,將油菜開發為蔬菜具有良好的效准科學基礎和巨大的潛力。近年來在浙江、确测湖北、定油的方湖南、菜中江蘇等長江流域主產區,维生因地製宜總結出“菜用+油用”、含量“菜用+花用+油用”等多種油菜高效利用開發模式。种高有研究表明,在適當的種植條件下,收獲油菜薹後並不會對油菜籽的產量造成顯著影響,此模式可有效增加農民種植油菜的生產效益。在長江流域油菜主產區,油菜作為冬季作物,不會影響到主要糧食作物的種植。利用冬閑田種植油菜,采用油蔬兩用技術(即先割菜薹,後收菜籽),對提升油菜種植的整體效益,增加農民收入,促進我國油菜產業發展具有重要意義。
油菜幼苗(5葉期)以及油菜薹中都含有豐富的維生素C以及其它營養物質,具有很高的食用價值。培育高維生素C油菜薹品種,既可提升油菜薹的菜用價值,也可為消費者提供健康營養的功能型蔬菜。維生素C又稱為抗壞血酸,是人體必需的主要維生素之一。對於一個普通成年人,人體所需的絕大多數其它維生素膳食推薦供應量都在20mg/d以下,而維生素C的膳食推薦供應量卻為100mg/d,是人體中需求量最大的一種維生素,當人體嚴重缺乏維生素C時會引起壞血病,還會造成人體免疫力的下降。維生素C是蔬菜和水果中最常見的抗氧化劑,參與人體內的多種氧化還原反應。有研究表明,維生素C不僅可以預防癌症,減少癌症的發生率,還可以改善和提高人體的免疫功能,同時具有預防心血管疾病的重要功能。人體自身無法合成維生素C,必須要從新鮮的蔬菜、水果等食物中獲取。準確並快速地測定出食物中的維生素C含量,對保證人體日常維生素C的攝取具有重要意義。
目前測定食物中維生素C含量的檢測方法主要有:碘酸鉀滴定法、熒光法、2,6-二氯靛酚滴定法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等,但大多操作繁瑣、測定效率不高等問題。在現行標準GB5009.86-2016中規定了高效液相色譜法、熒光法、2,6-二氯靛酚滴定法為測定食品中抗壞血酸的方法,其中2,6-二氯靛酚滴定法,操作簡單,但是如果樣品中有色素等物質會對滴定結果造成影響;熒光法耗時較長;而高效液相色譜法是一種簡單、高效、準確的測定方法。但目前國標中的高效液相色譜法采用的樣品前處理比較繁瑣,一個樣品從處理到上機檢測至少需要15min,測定效率不高。在對大群體樣本的維生素C進行檢測時,如何快速並準確篩選出高維生素C含量材料,提高維生素C檢測方法的效率就顯得尤為重要。
維生素C是一種水溶性維生素,分子式為C6H8O6,分子中相鄰的兩個羥基極易發生分解並釋放出H+,呈酸性並具有很強的還原性,導致維生素C極其不穩定。況且維生素C在常溫條件下易降解,樣品的貯藏條件影響檢測結果的準確性。為此本研究在國標的基礎上優化了測定維生素C的高效液相色譜法,改進後的方法可快速準確地測定樣品中維生素C的含量,同時利用液氮貯藏並研磨油菜樣品,使得該方法可操作期長、檢測結果重複性好、精確靈敏、回收率高,能長期保存,可用於大群體樣本中維生素C的分析鑒定及遺傳解析,為進一步研究油菜中維生素C的合成和遺傳機製奠定了方法基礎,有利於培育富含維生素C的油菜新品種。
2018年10月至11月在中國農業科學院油料作物研究所陽邏試驗基地所取的油菜幼苗(甘藍型油菜關聯群體材料,取樣時期為播種後30d左右)以及小白菜(兔子腿矮腳黃)、生菜(意大利全年耐抽薹生菜)、菠菜(大圓葉菠菜)(每種蔬菜的取樣時間均處於可食用狀態)。每種油菜選擇5株大小相近的材料(去掉油菜的根部和部分黃葉),小白菜、生菜、菠菜同樣各取大小相近的5株(去掉蔬菜的根部和部分黃葉)。
高效液相色譜儀(e2695,美國Waters公司)、PDA檢測器(2998,美國Waters公司)、色譜柱(C18柱,柱長250nm,內徑4.6nm,粒徑5μm,美國Waters公司)、瓶口分液器(5-50mL,德國Eppendorf公司)、萬分之一天平(JJ124BC,常熟市雙傑測試儀器廠)、十萬分之一天平(AUW220D,日本島津公司)、均質機(AD500S-P,上海昂尼儀器有限公司)、超聲波清洗機(SB25-12DT,寧波新芝生物科技股份有限公司)、真空抽濾裝置(DET-01P,達爾拓公司)、多功能粉碎機(JYS-M01,九陽股份有限公司)。
鹽酸(優級純,國藥集團化學試劑有限公司)、超純水(色譜純,Rephile-watersystem)、維生素C標準品(純度99%以上,德國Sigma-Aldrich公司)、乙酸銨(優級純,德國Sigma-Aldrich公司)、甲醇(色譜純,美國Fisher公司)。
尼龍66(Nylon)濾膜(直徑25mm、孔徑0.45μm,天津市津騰實驗設備有限公司)、尼龍66(Nylon)濾膜(直徑13mm、孔徑0.22μm,天津市津騰實驗設備有限公司)、微孔水相濾膜(直徑50mm、孔徑0.25μm,天津市津騰實驗設備有限公司)、2mL色譜進樣瓶(上海安譜實驗科技股份有限公司)、內插管(250μL,上海安譜實驗科技股份有限公司)。
提取液(1%HCl溶液)的配製:用移液槍吸取10mL鹽酸(優級純)於1000mL容量瓶中,加超純水定容,搖勻後備用。
流動相(20mmol/L的乙酸銨):用萬分之一的天平稱取1.54g乙酸銨,溶解於200mL的超純水中,超聲15min後,再用超純水定容至1000mL後繼續超聲脫氣15min。超聲結束後用真空抽濾泵過微孔水相濾膜(0.22μm)進行抽濾,過濾後的溶液裝入流動相瓶中備用。為避免因流動相的原因影響檢測結果的準確性,20mmol/L的乙酸銨需現配現用。
維生素C標準溶液(1000μg/mL):用十萬分之一的天平準確稱取0.1g維生素C標準品於100mL棕色容量瓶中,用1%的鹽酸溶解並定容,充分搖勻後放置在4℃冰箱中避光保存。
用萬分之一的天平準確稱取2g新鮮油菜或蔬菜樣品的葉片,置於50mL離心管中,並加入40mL提取液(即1%的HCl),用均質機將樣品完全均質破碎。用5mL注射器吸取已均質的樣品勻漿,過兩層濾膜(0.45μm+0.22μm),濾液過濾到250μL的內插管中,待上機檢測。
樣品儲存:將新鮮油菜或蔬菜樣品分別貯藏在4℃、-20℃、液氮(-196℃)條件下。3d後,將貯藏在4℃、-20℃的一部分樣品放入液氮中速凍,用多功能粉碎機磨成粉末狀(用之前先用液氮進行預冷),並置於50mL離心管中;剩餘樣品不進行研磨處理,直接稱取2g樣品,其它處理方法和檢測方法相同。測定出不同貯藏條件以及不同處理方式下油菜和蔬菜樣品中維生素C的含量。
色譜柱,美國WatersXBridge-C18色譜柱;流動相,甲醇和20mmol/L乙酸銨(兩者比例為7:93);流速,1.0mL/min;進樣量,10μL;目標柱溫,25℃;檢測波長,245nm;維生素C的保留時間,2.7min。
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