小麥過敏、干酪工方乳糜瀉、乳杆热加非乳糜瀉小麥敏感(NCGS)等“小麥相關疾病”在世界各地的菌发酵及發病率在不斷上升。對於這些疾病患者而言。式对避免攝入小麥致敏蛋白是小麦性唯一且有效的方法圈。除探究過敏機製、蛋白尋找治療的抗原突破點外，研發低致敏性的影响小麥食物成為當前亟待解決的問題。乳酸菌在發酵過程中通過自身的干酪工方蛋白質水解係統降解相關蛋白質及多肽，並通過產酸改變發酵麵團的乳杆热加pH值以激活麵粉的內源性蛋白酶.進一步加強蛋白質的降解。在蛋白質降解為多肽及氨基酸時，菌发酵及既改變了麵團風味，式对也改變了致敏蛋白的小麦性含量。此外，蛋白乳酸菌代謝產生的抗原抗真菌物質可以延長產品貨架期，產生的胞外多糖可以改善麵團的品質。鑒於此，乳酸菌發酵作為一種很有前景的發酵方式，值得進一步的探究。乳酸菌種類繁多，目前對於其降低小麥蛋白抗原性的研究多集中於植物乳杆菌發酵方麵。幹酪乳杆菌被證實具有細胞被膜蛋白酶，而這種酶在降解蛋白質的過程中起到很重要的作用。此外，大量研究表明加工方式影響食物蛋白的抗原性，目前用於降低食物蛋白抗原性的加工方法主要有熱加工(蒸煮、烘烤等)和非熱加工(發酵、酶解、超聲等)。蒸煮等熱加工方式會改變食物蛋白的構象結構，從而改變抗原的構象表位。而抗原蛋白線性表位的破壞主要發生在發酵和酶解過程中。Rao等研究發現低溫烘烤和水煮能夠產生較低致敏性的花生。Rui等利用植物乳杆菌發酵降低了大豆分離蛋白的抗原性。利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶連續酶解降低了小麥中致敏穀蛋白含量。本研究利用分離自老麵中的1株幹酪乳杆菌發酵麵團，研究其對小麥致敏蛋白含量及抗原性的影響，研究加工條件與抗原性之間的關係，為開發低致敏性小麥製品提供理論依據。
革蘭氏染色試劑盒、細菌組DNA提取試劑盒、乳酸杆菌選擇性瓊脂、Bradfbrd蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE分離/濃縮膠緩衝液、預染蛋白Maker、SDS-PAGE蛋白上樣緩衝液、AP-羊抗兔二抗、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒。北京索萊寶科技有限公司：EL-TMB顯色試劑盒，上海生工生物：試驗所用試劑均為分析純級，兔過敏血清由實驗室自製。
PCR熱循環儀，杭州晶格科學儀器有限公司；凝膠成像係統，上海勤翔科學儀器有限公司；Mul-tiskanFC酶標儀，上海賽默飛公司；mini-proteanⅡ凝膠儀，美國伯樂公司。
稱取酸麵團樣品5g於無菌均質袋中，加入45mL滅菌後的蛋白腖水(1％蛋白腖，0.43％NaCl，0.72％Na2HP04，0.36％KH2PH04，pH7.0)，混勻後梯度稀釋，取10-5～10-7稀釋梯度，塗布於乳酸杆菌選擇性瓊脂培養基，37℃培養24h。隨機挑取菌落進行過氧化氫酶和革蘭氏染色試驗。取過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性且鏡檢為杆狀的菌株進行進一步分子鑒定。
采用細菌組DNA提取試劑盒提取所分離菌株的DNA，利用細菌通用引物27F(5’-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTrGTACGA-3’)和1492R(5’-GCAGAGTTCTCGGAGT.CACGAAGAGTlTI’GATCCTGGCTCAG-3’)通過PCR反應對16SrRNA基因進行擴增。PCR反應條件為：94℃預變性5min：94℃變性30s。55℃退火30s，72℃延伸5min，35個循環：72℃充分延伸10min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測後送於北京生工生物工程有限公司測序。所得序列與NCBI文庫比對後，用MegaX構建進化樹。
取一支凍存菌種於MRS液體培養基中，37℃下活化24h。取O.5mL活化菌液於6個分別裝有30mLMRS肉湯的三角瓶中。37℃培養0，4，8，12，16，20h，在波長600nm處測量各時段菌液吸光度值，繪製生長曲線。
取活化菌液用MRS肉湯稀釋2，2.5，3，4，5，6倍，測定0D600nm值，並梯度稀釋，傾注於MRS瓊脂中，37℃培養48h後計算活菌數。
取指數生長期菌液，6000×g離心10min，生理鹽水洗滌2次，雙蒸水重懸浮至50mL，調節OD‰值為0.8。100g麵粉與50mL菌懸液投入和麵機。和麵15min，麵團內菌體數量約為108CFU/g。發酵溫度30℃，相對濕度80％。發酵24h，定時取樣。
每隔2h取樣，於無菌均質袋中10倍稀釋後混合均勻，測定pH值並用0.1mol/LNa0H滴定至pH值為8.3，記錄所消耗Na0H的體積數即，TTA值。
將發酵麵團樣品凍幹後磨粉於-20℃保存。蛋白提取參照Prado等的方法。具體操作如下：向500mg麵粉中加入10mL％s-HCl緩衝液(50mm01，L，pH8.8)，於4℃下攪拌1h，20000×g，4℃離心20min，收集上清液(清蛋白和球蛋白)；沉澱用5mL緩衝液洗滌3次，加入10mL75％乙醇，室溫下攪拌1h，離心20min，收集上清液(醇溶蛋白)；采用5mL75％乙醇洗滌沉澱3次，加入10mL50mmol/LTris-HCl(pH8.8，1％SDS，0.5％DTT)，4℃攪拌2h，離心20min，收集上清液(穀蛋白)。采用考馬斯亮藍法測蛋白質質量濃度。
參照Rao等的方法，具體操作如下：製備12％的分離膠和5％的濃縮膠，樣品溶液稀釋為相同濃度後與5x上樣緩衝液混合並沸水加熱5min，進樣後進行垂直電泳(濃縮膠電壓80V，分離膠電壓110V)，電泳結束後采用考馬斯亮藍R250染色，脫色後於凝膠成像係統拍照。
未染色的電泳膠轉移至硝酸纖維素膜上(300mA冰浴下轉膜90min)，麗春紅染色確認轉膜成功。加入5％脫脂奶粉，搖床上搖動封閉2h；加入稀釋的-抗(抗小麥蛋白兔血清)，4℃下孵育過夜；TBST緩衝液(0.02mol/LTBS，0.05％Tween-20，pH7.6)洗膜後，加入稀釋的AP-羊抗兔二抗，室溫下孵育90min；洗膜後。利用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。
向100g麵粉(乳酸菌菌落數108～109CFU/g)中加入50mL菌懸液和0.35g安琪酵母調製麵團後分別發酵。冷藏發酵條件為：4℃發酵3d後於37℃，80％相對濕度發酵60min：一次發酵條件為：37℃，80％相對濕度發酵60min；二次發酵條件為：中種麵團(60g麵粉，0.35g酵母，30mL菌懸液)於37℃發酵4h後加入40g麵粉和20mL水繼續發酵1h。發酵好的3種麵團用於烤製(180℃，20min)和蒸製(沸水蒸製20min)。取樣凍幹，磨粉備用。
總蛋白提取參照Akagawa等的方法，具體操作如下：25mg麵粉加入1mL蛋白提取液[40mmol/LTris，8mol/L尿素，4％3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(cHAPs)，冰浴下超聲提取30s，6次；4℃下16000×g離心20min，收集上清液，考馬斯亮藍法測蛋白質量濃度。
采用酶聯免疫吸附試驗評價樣品抗原性。使用50mmol/L，pH9.6的碳酸鹽緩衝液稀釋蛋白至5μg/mL，按100μL孔加入酶標板，4℃靜置過夜；用TBST洗板4次，按150μL/孔加入1％BSA封閉液，37℃溫育2h；TBST洗板後按100μL/孔加入使用1％BSA稀釋的抗小麥蛋白兔血清稀釋液(1:10000)，37℃溫育2h，洗板；按100μL/孔加入500倍稀釋的羊抗兔HRP-IgG，37℃溫育1h，洗板；使用TMB顯色試劑盒顯色，於波長450nm處測0D值。
試驗數據用SPSS軟件處理，圖由GraphPadPrism繪製。
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