為了進一步分析造成不同批次樣品之間差異的基于结合化學成分，在PCA的指纹蛭益制基礎上進行PLS-DA處理。模型區分參數R2Y=0.966，图谱模型預測參數Q2=0.91，化学表明建立的模式模型有效穩定。同樣可將16批樣品分為3類，识别肾胶進一步驗證了HCA和PCA的囊质結果；以PLS-DA模型中重要性投影（VIP）值>1.0篩選不同批次樣品間的差異性成分，VIP值的量控大小表明了對樣品分類的貢獻度的程度。據圖5可知，基于结合共找到8個成分，指纹蛭益制分別為：13號峰（黃芪異黃烷苷）、图谱11號峰（人參皂苷Rg1）、化学7號峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、模式21號峰（7,识别肾胶2'-二羥基-3',4'-二甲氧基異黃烷）、6號峰（鬆脂醇二葡萄苷）、囊质16號峰（毛蕊異黃酮）、20號峰（芒柄花黃素）、4號峰（綠原酸），表明這8種成分對黃蛭益腎膠囊質量差異影響較大。8種成分分別來自於黃芪、三七、益母草、墨旱蓮、杜仲，其中5個成分歸屬於君藥黃芪藥材，進一步說明黃芪藥材對黃蛭益腎膠囊的質量影響較大。
本實驗分別考察了超聲提取方法的不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇和甲醇）、提取時間（30、45、60 min）和提取料液比（1∶5、1∶10、1∶15）等影響因素，從提取的色譜信息全麵性、色譜峰的響應、操作便捷性等方麵考慮，確定供試品溶液最佳製備方法為加10倍量甲醇超聲提取30 min。比較了4種不同流動相係統（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水），乙腈-0.05%磷酸水作為流動相所得色譜峰形、響應及分離度均較好；采用DAD檢測器對檢測波長進行考察，發現在210 nm處的圖譜信息較多，峰響應較高；由於樣品中極性大的成分較多，優先考慮親水性型色譜柱，分別選擇Waters Atlantis T3(250 mm×4.6 mm,5μm）、Inter Sustain AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5μm）、Waters Symmetry Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm）、Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm），同一色譜條件下進樣，結果表明Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm）色譜柱的分離效果較好，峰數量較多且分離度較好，故采用該款色譜柱。
本研究建立了黃蛭益腎膠囊的指紋圖譜，16批樣品中確定24個共有峰，通過HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定了化合物，並通過陽性藥材和陰性製劑樣品比對歸屬到7味藥材。相似度評價結果表明16批黃蛭益腎膠囊相似度在0.925～0.995，總體上質量較為均一。但通過HCA、PCA和PLS-DA化學模式分析，16批黃蛭益腎膠囊共有峰峰麵積存在差異，從而造成樣品之間的質量差異。通過聚類圖可知，16批樣品被分為3類，結合樣品批號信息，3類間的差異可能與生產時間、藥品儲存、原藥材質量有關。以PLS-DA模型中的VIP值選出8種差異性成分，可作為控製黃蛭益腎膠囊質量的關鍵，這幾種成分分別來自黃芪、三七、杜仲、益母草、墨旱蓮，提示生產企業以後在藥品生產中應該著重關注以上成分的變化以及這幾味原藥材的質量。
本實驗操作簡單，可行性高，實用性強，基於指紋圖譜的基礎上初步分析了藥品物質基礎，為黃蛭益腎膠囊所含成分的進一步分析奠定基礎，為更加科學、高效地控製藥品質量提供參考依據。黃蛭益腎膠囊所含藥味眾多，本實驗指紋圖譜歸屬到的藥材僅7味，還有枸杞、薏苡仁、山藥等藥材成分未在此指紋圖譜結果中體現，主要是由於這類藥材所包含成分多為水溶性等大極性成分，色譜分離難度較大，針對此類化合物的分析後續擬采用HILIC模式進行分析。黃蛭益腎膠囊中的黃芪、牛膝、三七等藥材同樣包含大量皂苷類成分，此類成分在紫外中沒有吸收，日後可結合蒸發光散射（ELSD）或電噴霧（CAD）檢測器開展其成分分析，以期完善其成分分析。
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