多花指甲蘭為蘭科指甲蘭屬附生草本植物,多花花型奇特,指甲柱狀似“狐尾”,兰花力及花序密集,粉活花大部白色,可授稍有紫色點綴其間,性研觀賞價值高。多花更重要的指甲柱是,多花指甲蘭極具芳香,兰花力及獨特的粉活芳香性狀也是多花指甲蘭的重要價值之一。其含有醛類、可授芳香族類、性研酯類、多花酮類以及萜類化合物等多種揮發性物質,指甲柱可廣泛應用於化妝品、兰花力及美容等行業,近年,一家日本公司公布了其香水專利,構成其產品成分的一種主要香味物質便來自於此。同時,多花指甲蘭也是重要的藥用蘭花,在印度東北部當地部落居民有使用指甲蘭屬植物治療常見疾病的習俗,孟加拉國和泰國也有相關報道,國內研究人員也發現指甲蘭屬植物有作為抗癌藥物潛能。多花指甲蘭不僅擁有花型、花色和香味等眾多優良性狀,是不可多得的優秀親本資源,而且在醫藥業、化工業也廣泛運用,具有重大開發潛能。多花指甲蘭常附生於喬木上,由於過度的資源開采、旅遊開發等生態破壞行為,以及對其附生樹種的亂砍濫伐、野生植物非法貿易,導致多花指甲蘭野生種群的生存麵臨極大威脅。CITES(《瀕危野生動植物種國際貿易公約》)將指甲蘭屬的所有種列入其附錄Ⅱ的保護對象。我國也將其列入國家重點野生植物保護名錄(第二批次)。我們應積極對其采取相關保護措施。但由於種質資源匱乏等原因,國內目前較少見到多花指甲蘭的相關報道,花粉形態觀察和花粉活力測定以及柱頭可授性更是鮮有報道,還有極大的挖掘空間。
花粉和柱頭具有較高的活性是雜交育種成功的關鍵,目前,國內外主要使用花粉染色法和花粉離體培養測定花粉活力。常見染色方法有醋酸洋紅染色法、I2-IK染色法和TTC染色法。據文獻報道,最符合真實值的方法為TTC染色法;而花粉離體培養是最能反映真實值的方法。柱頭可授性均利用聯苯胺-過氧化氫法測定。當前,僅有少數研究人員以市場上常見的幾種蘭花為材料進行了花粉形態、花粉活性以及柱頭可授性的研究。褚怡等研究了大花蕙蘭和幾種國蘭的花粉活力和柱頭可授性,喻蘭等對蝴蝶蘭的花粉活力和柱頭可授性進行了測定。羅遠華等以20個文心蘭種質為材料,對花粉活力進行測定。這些研究明確了各材料最佳的授粉時機,為蘭花的雜交育種、引種栽培提供了理論指導。本文在前人的基礎上對多花指甲蘭的花粉形態、花粉活力以及柱頭可授性開展研究,以期為多花指甲蘭的雜交引入、遷地保護以及後續的應用開發提供理論指導。
材料來源於雲南省瀾滄縣(99°29′E~100°35′E、22°01′N~23°16′N之間),為野生種,目前種植於海南大學育苗基地(20°03′N,110°19′E)。使用試劑為氯化三苯基四氮唑(TTC)、I2-KI以及醋酸洋紅染液。試驗器材為鑷子、解剖針、解剖刀、蓋玻片、載玻片、10mL離心管、恒溫培養箱、光學顯微鏡(BA210-T)等。
采集花蕾期、盛花期、衰敗期的多花指甲蘭花粉(圖1),經離子濺射儀噴金後,置於場發射掃描電子顯微鏡下觀察(S-4800)。選取各時期花粉在30×、100×、500×的視野下觀察並對各開花時期花粉塊的形態結構進行拍照記錄。
結合胡適宜與羅遠華等的方法,並在此基礎上進行優化,具體為用pH為7.2~7.4的10×0.01mol/L磷酸緩衝液配0.5%的TTC溶液、I2-KI以及醋酸洋紅染液取不同開花時期新鮮花粉團,將花粉搗碎於載玻片上,用鑷子與解剖針使之充分分散,然後滴加適量新鮮配製的TTC染色液、I2-KI以及醋酸洋紅染液,蓋上蓋玻片,用錫箔紙包裹黑暗處理置於35℃恒溫箱中。24h後在光學顯微鏡下觀察統計花粉活力,每張片子隨機計數5個視野的染色率,染成紅色的為活力強的花粉,淡紅色為活力弱的花粉,無活力或不育的花粉無法被染色。
以錢鑫等、郭麗霞等的研究為基礎對培養基進行優化,預實驗結果表明,最適培養基為:20%蔗糖+20mg/L硼酸+10mg/LCaCl2,在25℃恒溫中暗培養48h之後於光學顯微鏡下觀察花粉萌發情況,以花粉管長度超過花粉粒直徑的2倍為萌發標準,並選擇3個視野進行計數。
用聯苯胺-過氧化氫法測定多花指甲蘭柱頭活性。聯苯胺-過氧化氫反應液用1%聯苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22配製,現配現用。取不同開花時期的新鮮雌蕊柱頭,放入培養皿中,加入檢測液使之沒過柱頭,反應10min。在體視顯微鏡下觀察氣泡產生情況以及柱頭變色情況。
數據采用Microsoftoffice2010及GraphPadPrism8分析軟件進行分析作圖。
與其他形態和生理特征相比,花粉形態保持相對穩定,因此花粉形態可以作為更好的分類和係統發育標記。多花指甲蘭花粉團附著於有柄的粘盤上,花粉呈黃色,蠟質,2個。在掃描電鏡下可以清晰的觀察到每個具半裂的裂隙,表麵稍有凹陷,無紋飾,近球形(圖2A),粘盤柄狹長,粘盤較寬(圖3A)。每個花粉團均由大量形狀不規則花粉粒通過類脂質粘合而成。由圖2~圖4和表1可知,隨著開花時間延長,花粉粒皺縮,體積變小,整個花粉團體積也相應變小,花粉團表麵變得更加緊密平滑。尤其是開花10d後時,即衰敗期,花粉粒表麵致密平滑。
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