2.8 10批樣品含量測定
分別取10批樣品(批號：20160324、马香20160616、苓口立20160623、服液方法20160625、中白酯Ⅲ20160704、术内20160705、含量20160712、测定20160714、马香20160717、苓口立20160721、服液方法20160724)按供試液法每批次各平行製備2份供試液，中白酯Ⅲ按色譜條件自動進樣測定，术内其對照液白術內酯Ⅲ(濃度71.76 μg/mL)分別進樣30、含量20、测定10 μL，马香且每個進樣量分別進樣2次；每份供試液各進樣2針，記錄色譜圖和峰麵積，並計算含量以及RSD值(表7)，計算得馬香苓口服液中白術內酯Ⅲ不同進樣量含量分別為2.15、2.58、2.54，平均含量為2.43 μg/mL，相對含量RSD=9.82%。考慮到大規模生產中的各種損失和測量誤差，取其平均值的80%作為其含量限度，即2.43×0.80=1.94，故暫定馬香苓口服液中白術藥材按白術內酯Ⅲ計不少於1.94 μg/mL。
3 討論
3.1 待測組分選擇
白術的內酯類成分具有抗炎、增強免疫、利尿等作用，而且還可以調理胃腸道和促進營養物質的吸收，其中白術內酯Ⅰ、Ⅲ的藥理作用較為明顯，也是發揮白術健脾益氣、燥濕利水的功效之一。在炮製過程中蒼術酮被氧化，其產物是雙白術內酯、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ，同時白術內酯Ⅲ在經高溫加熱過程中會生成白術內酯Ⅱ；從氧化反應機製來看，蒼術酮易與水發生加成反應，生成半縮醛羥基，而水又導致半縮醛羥基開環生成羰基，羰基進一步被氧化生成羧基，雜化軌道平麵兩側容易被羥基進攻羧基，羥基並與羧基進行分子內脫水反應，可生成白術內酯Ⅰ和表白術內酯Ⅰ，而白術內酯Ⅰ在7位上與碳相連的氫相比較為活躍，易被羥基取代而生成白術內酯Ⅲ。白術內酯Ⅲ的結構較其穩定，更有利於含量測定。
3.2 供試液前處理
按照萃取溶劑的方法，考察了正丁醇、石油醚(30℃～60℃)、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯等有機溶劑，經過與標準品色譜法相比較，石油醚(60℃～90℃)所萃取得到的供試液峰形較好，分離度高，但其前麵有一小雜峰，後改用甲醇、500 mL/L甲醇水溶液、乙醇、750 mL/L乙醇等作為複級溶液，考慮到白術內酯類成分的穩定性，並同時選擇了考察柱溫的最佳條件(20℃、30℃、35℃)，結果表明，在柱溫為25℃、選用500 mL/L甲醇水溶液作為複級溶液，所出的峰形分離度高，峰形對稱且含量較高。有關提取次數優選，在其他相同條件下，用石油醚(60℃～90℃)振搖提取3～5次，結果表明，用供試品提取3次與4、5次有較大差異，而4、5次時白術內酯Ⅲ含量無明顯差異，故選擇用石油醚(60℃～90℃)振搖提取4次。
3.3 色譜條件選擇
本製劑通過單因素試驗，對其柱子型號、柱溫、流速、流動相比例進行優化和係統適用性試驗以及波長的選擇，用紫外分光光度計測量白術內酯Ⅲ的最大吸收波長，結果在223 nm處吸收峰最強；在流動相選擇上參考其他學者研究，用標準品白術內酯Ⅲ進行判定等度條件下使用甲醇-水(60∶40)、乙腈-水(60∶40)的出峰情況，試驗表明用甲醇-水(60∶40)對其標準品的峰更好，含量更高，同樣條件下進樣測定供試液，發現其分離度達不到《中國獸藥典》的要求，雜峰較多，故進行了梯度洗脫，考慮中藥成分複雜多樣，會影響色譜柱的質量以及下一針進樣的出峰情況，故在樣品目標峰等完全出完過後使用了純甲醇進行衝洗色譜柱10 min， 然後用15 min再平衡到流動相的初始比例以方便下一針進樣分析，最終確定了流動相條件。在其他條件不變情況下，柱溫的改變對其供試品溶液中白術內酯Ⅲ含量的相對標準偏差為4.15%，且柱溫過高，易導致峰形不對稱，有拖尾現象，綜合考慮，最終選用柱溫為25℃；在柱溫25℃等其他條件不變情況下，改變流速0.8 mL/min±0.2 mL/min， 發現供試品溶液中白術內酯Ⅲ含量相對標準偏差為3.49%，說明改變流速對樣品中白術內酯Ⅲ的測定無影響，對其樣品出峰時間早晚有一定影響，但對峰的對稱性、分離度無影響，故最終確定流速為0.8 mL/min。
試驗證明以流動相甲醇-水(體積比)進行梯度洗脫(甲醇60→65、水40→35運行30 min， 甲醇65→100、水35→0運行2 min， 甲醇100、水0運行10 min， 甲醇100→60、水0→4運行3 min， 甲醇60、水40運行15 min)、檢測波長223 nm、柱溫25℃、流速0.8 mL/min的色譜條件對白術內酯Ⅲ的測定具有較強的專屬性，能達到基線平衡、與其他組分離度較高、峰形對稱、陰性對照無幹擾、大大縮短分析時間，便於作為含量測定和方法學研究。
建立的HPLC方法測定白術內酯Ⅲ含量的線性關係良好，精密度、重複性、穩定性試驗的平均峰麵積RSD分別為2.00%、6.00%和8.58%；平均加樣回收率為98.04%，RSD=11.89%，其回收率相對良好，進行10批樣品的含量測定，暫定馬香苓口服液中白術藥材按白術內酯Ⅲ計不少於1.94 μg/mL。表明所建立的HPLC特征圖譜專屬性強、準確可行、簡便，可快速用於鑒別馬香苓口服液中白術內酯Ⅲ以及其含量，可有效地用於該製劑的質量控製，同時該方法還可以為進一步加強含白術類化合物的製劑質量控製提供參考，為申報新獸藥質量標準提供一定的數據支撐。
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