參照文獻方法,用氧嗪酸鉀和尿酸腹腔注射小鼠。氨基連續2天,脲对造成小鼠高尿酸血症模型。黄嘌化酶雄性昆明種小鼠適應性飼養一周後,呤氧隨機分成正常對照組、制作高尿酸模型組、用研別嘌呤醇組、肉桂肉桂醛縮氨基脲組、醛缩肉桂醛組共5組,氨基每組10隻。脲对正常對照組和高尿酸模型組,黄嘌化酶每天按20mL/kg劑量灌胃生理鹽水,呤氧持續6天。制作別嘌呤醇組每天按10mg/kg劑量灌胃1次,持續6天。肉桂醛組、肉桂醛縮氨基脲組小鼠每天按0.1g/kg劑量灌胃6天。從給藥第5天開始,除正常對照組外,其他各組每天灌胃前1h均要腹腔注射0.3g/kg氧嗪酸鉀和0.25g/kg尿酸,每天1次,連續2天進行造模。在第6天灌胃1h後,小鼠進行斷頭采血,血樣分別置於1.5mL離心管中,在4℃冰箱中凝固2h,在4℃下3000r/min離心5min。每份血清進行血尿酸和血清XOD活性測定。采血後,取出肝髒,勻漿處理,離心取上清,測XOD活性。
用尿酸測定試劑盒測定血尿酸質量濃度,用試劑盒法測定小鼠血清XOD和肝髒XOD活性。
用SPSSl9.0軟件進行統計分析,計量資料以平均值±標準偏差表示,組間比較用t檢驗。
化合物a(肉桂醛縮氨基脲,cinnamicaldehydesemicarbazone,CAS):無色針晶(CH30H);UV(MeOH)λmax308,306nm;IR(KBr)νmax3282,1644,1604cm-1;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6);δ10.174(s,1H,NH)7.653(s,1H,CH=N),7.49(d,2H,Ph-H),7.345(t,2H,Ph-H),7.265(t,1H,Ph-H),6.852(d,2H,CH=CH),6.26(s,2H,NH2);ESI-MS,m/z=189.23,[M+H]+(C10H11N30)。其IR、1H-NMR、ESI-MS數據與文獻報道一致。
化合物b(肉桂醛縮氨基硫脲,cinnamaldehvdethiosemicarbazide,CT):淺黃色菊花晶(CH30H);UV(MeOH)λmax352,348nm;IR(KBr)νmax3262,1592cm-1;1H-NMR(400MHz,DMS0-d6):δ11.350(s,1H,NH),8.123(s,1H,CH=N),7.859(d,1H,Ph-H),7.539(d,2H,NH2),7.541(d,1H,Ph-CH=),7.341(t,3H,Ph-H),6.998(d,1H,Ph-H),6.838(q,1H,=CH-);ESI-MS,m/zMr=205.3,[M+H]+(C10H11N3S)。其IR、1H-NMR、ESI-MS數據與文獻報道一致。
化合物c(肉桂醛縮甲基氨基硫脲,cinnamaldehvdeshrinkagemethvlthiosemicarbazide,CSMT):黃色粉末(CH30H);UV(Me0H)λmax305,358nm;IR(KBr)νmax3362,1552cm-1;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.401(s,1H,NH),8.24(s,1H,CH=N),7.87(d,1H,CH=),7.521(d,2H,Ph-H),7.36(t,2H,Ph-H),7.294(t,1H,Ph-H),6.988(d,1H,CH=),6.833(m,1H,NH),2.942(d,3H,CH3);ESI-MS,m/zMr=219.32,[M+H]+(C11H13N3S)。
化合物d(肉桂醛縮4-苯基氨基硫脲,cinnamaldehvdeshrinkagephenvlthiosemicarbazide,CSPT):無色針晶(CH30H);UV(MeOH)λmax305,350nm;IR(KBr)νmax3313,1594cm-1;1H-NMR(400MHz,DMS0-d6):δ11.79(s,1H,NH),9.89(s,1H,NH-Ph),7.98(s,1H,CH=N),6.96(dd,1H,=CH-),7.05(d,1H,Ph-CH=),7.15(d,1H,Ph-H),7.35(m,5H,Ph-H),7.58(dd,4H,Ph-H);ESI-MS,m/zMr=281.39,[M+H]+(C16H15N3S)。其IR、1H-NMR、ESI-MS數據與文獻報道一致。
肉桂醛及其席夫堿衍生物對XOD的抑製率見圖2。其中各折線依次代表抑製劑別嘌呤醇、肉桂醛縮氨基脲、肉桂醛、肉桂醛縮苯基氨基硫脲、肉桂醛縮甲基氨基硫脲、肉桂醛縮氨基硫脲。由圖2可知,同一種抑製劑,濃度越大,酶活性越低。別嘌呤醇、肉桂醛縮氨基脲、肉桂醛、肉桂醛縮苯基氨基硫脲、肉桂醛縮甲基氨基硫脲、肉桂醛縮氨基硫脲抑製XOD的IC50值分別是(7.05±0.14)、(55.48±0.54)、(90.93±0.72)、(122.48±0.65)、(201.29±0.88)、(241.57±1.32)μmol/L(n=3)。各化合物活性順序是別嘌呤醇>肉桂醛縮氨基脲>肉桂醛>肉桂醛縮苯基氨基硫脲>肉桂醛縮甲基氨基硫脲>肉桂醛縮氨基硫脲。
肉桂醛縮氨基脲對XOD抑製活性比肉桂醛強,且活性接近陽性藥別嘌醇。肉桂醛縮氨基脲抑製XOD活性比肉桂醛縮氨基硫脲類化合物強,可能與氨基脲上的羰基能與XOD酶上的氨基酸殘基形成氫鍵,而硫脲不能形成氫鍵有關。抑製XOD活性,苯基取代硫脲>甲基取代硫脲>硫脲。這可能與疏水性有關,苯基的疏水性最大,其次是甲基,然後是無取代基。即疏水性基團越大,抑製活性越好。由於肉桂醛縮氨基脲抑製XOD活性最強,以下測定抑製機理和抑製類型就隻研究肉桂醛縮氨基脲。
在測活體係中,固定底物黃嘌呤濃度,改變XOD酶的質量濃度,測定不同濃度的抑製劑肉桂醛縮氨基脲(0、50、75、100μmol/L)對XOD酶活性的影響。由圖3可知,以酶促反應的速度對酶質量濃度作圖,為一組通過原點的直線,由此判斷肉桂醛縮氨基脲對XOD抑製機理為可逆抑製。
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