黑木耳作為一種珍貴的黑木傳統食用真菌，不僅能為人體提供氨基酸、耳胞蛋白質、外多微生膳食纖維等營養物質，糖对态及還具有抗氧化、小鼠响抗腫瘤、肠道降血糖和預防心血管疾病等多種活性功能。免疫黑木耳含有多種營養成分，调节的影其中所含多糖成分的黑木作用研究較為廣泛，尤其是耳胞在食品和保健品開發方麵具有應用價值，如黑木耳飲料、外多微生黑木耳口服液等。糖对态及研究發現，小鼠响黑木耳多糖能夠顯著提高機體免疫力，肠道抑製小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力，免疫增強其巨噬細胞吞噬能力和自然殺傷細胞活性。腸道微生物是人體的重要代謝“器官”，在消化吸收、新陳代謝和免疫反應等生命活動中發揮關鍵性作用。隨著對腸道微生物與機體健康研究的深入，發現正常生理條件下人體腸道菌群處於動態平衡狀態，當內環境變化或受到外界刺激時，會導致腸道內菌群紊亂，對機體健康產生影響。例如，抗生素濫用會破壞腸道微生物種群平衡，增加炎症性疾病風險。益生菌通過分泌一係列抗菌物質（有機酸、過氧化氫和細菌素等）降低腸內pH，增加短鏈脂肪酸（Shortchainfattyacid，SCFA）含量來減少病原體活菌數。研究發現，多糖可以促進腸道優勢菌增殖和調節腸道內分泌物，從而促進腸道內環境穩態和機體健康。
盡管黑木耳具有較高的營養價值和廣闊的應用前景，但是其多糖成分對腸道微生物的調控作用與機製仍不清楚。為了明晰黑木耳多糖對腸道菌群變化的調控效應及其生物功能，本研究利用小鼠模型，分析黑木耳胞外多糖對小鼠腸道菌群多樣性、SCFA含量變化及血清細胞因子的影響，為黑木耳多糖益生菌微生態製劑和新型健康食品的開發提供理論基礎。
黑木耳菌株（GenBank：KF297975.1，天津科技大學生物醫藥與分子生物學實驗室保存）。無水乙醇（分析級）、葡萄糖（分析級）、濃硫酸（分析級）、二甲苯（分析級），天津北方天醫化學試劑廠；三氯甲烷（分析級）、異戊醇（分析級）、二氯甲烷（色譜級），上海生工生物工程有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸，上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸鈉抗原修複液，上海碧雲天生物技術有限公司；牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司；GPR43抗體，聖克魯斯生物技術（上海）有限公司；FIＴC標記的熒光二抗，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒，上海茁彩生物科技有限公司。
SPF級近交係CD-1雌鼠18隻，體重（20±3）g，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，購於北京維通利華實驗動物技術有限公司。
AB204-S型分析天平，梅特勒-托利多儀器上海公司；GH-6000型電熱恒溫培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；ALPHA2-4/LD型冷凍幹燥機，德國CHRIS公司；722型紫外分光光度計，上海精科儀器公司；7890A氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；BX53正置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。
黑木耳發酵培養參照肖彩霞的方法。發酵液經3000r/min離心20min棄沉澱，上清液直接進行真空蒸發，濃縮至原體積的1/4，加入無水乙醇（體積分數30%），4℃過夜。3000r/min離心20min後，向上清溶液加入去蛋白試劑（三氯甲烷異戊醇=1∶4）並磁力攪拌10min，3500r/min離心15min棄沉澱，上清液加入無水乙醇（體積分數75%）4℃過夜。4000r/min離心15min取得沉澱物即為粗多糖，將多糖沉澱用水複溶後透析12h，每2h換1次水，隨後冷凍幹燥，得到黑木耳胞外多糖。
稱取黑木耳胞外多糖1mg，加入適量溴化鉀（KBr）粉末於研缽中，充分研磨後壓成透明薄片，隨後用NicoletIS10FＴIR光譜儀（ＴhermoScientific，美國）在400～4000cm-1波數範圍內掃描，記錄IR光譜。
本試驗利用高效液相色譜儀，結合PMP（1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮）柱前衍生化法對黑木耳胞外多糖樣品進行了單糖組成分析。多糖的水解和衍生化方法參照王媛媛等研究。高效液相檢測條件如下：C18色譜柱；流動相為0.1mol/LpH6.5磷酸緩衝鹽∶乙腈（V/V）=85∶15；流速1mL/min；柱溫40℃；檢測波長250nm；進樣量20μL。
將購買的18隻健康CD-1雌性小鼠飼養在20～22℃、45%～55%RH的無菌潔淨環境中，讓其自由進食（市售普通飼料），適應性喂養7d。將其隨機分為2組（每組9隻）即試驗對照組（Control），黑木耳胞外多糖組（Fermentation-exopolysaccharide，F-P）。將黑木耳胞外多糖用生理鹽水配置，然後按照1.5g·kg-1BW-1進行灌胃處理（每隻小鼠每次給藥體積為0.2mL），連續灌胃21d；對照組給予等體積的生理鹽水處理。
試驗期間每7d記錄1次小鼠體重，將兩組體重平均值做趨勢分析。第21天，脫臼法處死小鼠後，快速分離肝、脾、心、肺、腎等髒器，髒器用吸水紙吸幹後，進行稱量和數據采集，最後對髒器係數及安全性進行評估。
髒器係數=（髒器質量/體重）×100%。
灌胃試驗結束後（第21天），無菌采集新鮮糞便0.1g，放入滅菌管，將待測樣品交派森諾生物科技有限公司進行菌群鑒定分析。流程如下：首先提取樣品細菌總DNA，然後以微生物核糖體RNA目標序列為靶點，設計16SrRNAＶ3-Ｖ4區的特異性引物，等溫擴增構建文庫。構建好的文庫經梯度稀釋，利用IlluminaMiSeq測序平台高通量測序。測序結果通過生物信息學方法進行亞基因組分析和腸道微生物區係分析。
冷凍幹燥糞便樣品，準確稱取50mg樣品，加入1.2mL磷酸鹽緩衝液（pH7.3）混勻，4℃14000r/min離心20min，吸取上清液至5mL離心管中。每200μL上清加入0.1mL的稀釋後硫酸（體積分數50%），充分混勻3min，用2mL二氯甲烷（色譜級）進行萃取，4℃靜置2h，然後用0.22μm有機濾膜過濾。采用氣相色譜（GC）檢測樣品中短鏈脂肪酸的含量，樣品提取方法參照Zhao等並做部分修改。GC分析采用常規HP-FFAP（25m×0.32mm，0.5μm）配置柱，程序設定參照賈益群等在生物樣品脂肪酸提取與分析的研究結果，並調整其分流比為20∶1。SCFA標準品溶液的配置以及標準曲線繪製參照孟拓等對氣相色譜-質譜聯用法分析腸道炎小鼠短鏈脂肪酸代謝研究結果。
小鼠灌胃21d後，脫臼法處死小鼠快速分離腸道交武漢穀歌生物科技有限公司製作石蠟切片。取結腸石蠟切片用二甲苯脫蠟處理，經不同濃度梯度乙醇進行水化處理後用檸檬酸鈉抗原修複液95℃溫育15min進行抗原修複，並將其冷卻到室溫，經3%BSA室溫封閉處理30min後用GPR43抗體4℃孵育12h，之後用FIＴC標記的熒光二抗室溫避光孵育1.5h，再用DAPI室溫避光孵育30min，實施封片並過夜風幹，於暗室條件下進行熒光顯微鏡觀察。
小鼠灌胃21d後，通過摘眼球取血，並將血液保存在含有乙二胺四乙酸絡合劑（EDＴA）的收集管中，4℃存放3h。待自然沉降後，用無菌槍頭吸取血清，利用酶聯免疫法（ELISA）測定小鼠血清中IL-6、IL-10和ＴNF-α的含量。試驗步驟參照上海茁彩生物科技有限公司ELISA試劑盒操作說明書。
試驗結果采用Graphpad5.0分析軟件統計分析，t檢驗分析各組間顯著性差異，數據以x-±s表示，當P＜0.05時，認為具有顯著性差異。
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