油菜是白菜我國重要的油料作物,其角果一般由兩心皮的雌蕊發育而來,角果內被假隔膜分為兩室,種子著生於其中,外被兩片殼狀果瓣。在自然界中也發現了多室油菜突變體,型油性状析分其角果由多心皮雌蕊發育而成,角果內被假隔膜分為3～5室,外被3～5片殼狀果瓣。這種自發突變體資源十分稀少,菜s传分其中白菜型油菜(Brassicarapa,AA,2n=20)中主要有印度的黃籽沙遜多室油菜和中國西藏的桑日白油菜等2種多室材料；在芥菜型油菜(B.juncea,AABB,2n=36)中有山西的三筒油菜、貴州的多室的遗四輪油菜、青海的鉴定多室油菜和四川的四棱油菜等多室油菜。已有研究表明,白菜多室油菜相對於兩室油菜主要具有兩大優良特性:(1)多室油菜具有較多的每角果粒數,可顯著提高單株產量,在油菜的高產育種中具有應用潛力；(2)多室角果的抗裂角性較強,可用於抗裂角的研究和育種。因此,型油性状析分多室油菜作為一種新的種質資源,闡明其形成的遺傳和分子機理,不僅可以豐富油菜花器官形態建成的理論,也有助於油菜高產新品種的培育。
遺傳研究表明,菜s传分白菜型油菜中的多室/兩室相對性狀受1對主效核基因的控製,兩室性狀對多室性狀表現為完全顯性,且無細胞質效應的影響。通過圖位克隆的多室的遗方法,Fan等發現,擬南芥CLV3(CLAVATA3)的同源基因調控黃籽沙遜ml4多室角果的形成；轉基因互補測驗和體外多肽的處理試驗證明,該基因的1個單核苷酸突變(C/T)導致其CLEmotif中第9位的脯氨酸突變成亮氨酸,引起CLV3多肽活性的喪失,最終導致了油菜多室角果的產生。在芥菜型油菜中,鉴定多室性狀受1個隱性核基因或2個獨立遺傳的隱性核基因控製,同樣兩室對多室表現為完全顯性,且無細胞質效應的影響。通過基因的白菜精細定位,Xiao等和Xu等分別將擬南芥CLV3多肽信號的受體CLV1(CLAVATA1)的同源基因作為芥菜型油菜A7染色體上的多室候選基因。Xiao等進一步證實,型油性状析分BjuA07.CLV1基因編碼區和啟動子上的序列變異導致了芥菜型油菜多室的產生。在模式植物擬南芥中,菜s传分CLV信號途徑調控了莖頂端分生組織內幹細胞的分裂與分化之間動態平衡；當CLV3多肽信號或其受體發生突變時,CLV信號的傳遞就會受到影響,從而導致頂端分生組織的幹細胞數目增加、多心皮雌蕊和多室角果的多室的遗產生。鑒於CLV信號途徑在植物多室性狀形成中的鉴定重要作用,Yang等利用基因編輯技術對甘藍型油菜中的CLV3、CLV1和CLV2等同源基因進行了突變,創建了具有穩定多室性狀的突變體資源。由此表明,CLV信號途徑在不同類型油菜的多室角果形成過程中具有功能保守性。
來自西藏的桑日白油菜(簡稱srb)是目前在我國發現的僅有的白菜型多室突變材料,與黃籽沙遜多室油菜具有完全不同的來源；該突變體的多室性狀表現穩定,且受1對隱性基因控製。但至今仍然沒有該材料中的多室基因精細定位和克隆的相關研究報道。因此,本研究對srb突變體的遺傳進行了分析,並通過與ml4突變體的等位測驗以及候選基因的驗證,發現了該材料中存在的一種新的BrCLV3基因等位突變導致了多室角果的產生。該研究為進一步深入解析BrCLV3基因參與油菜多室性狀形成的分子機製提供了重要的材料。
所用的白菜型油菜包括兩室黃籽沙遜(野生型,簡稱WT)、多室黃籽沙遜ml4以及來自西藏的多室srb。將srb分別與WT和ml4進行正反交得到F1,然後自交產生F2分離群體,用於srb多室性狀的遺傳分析。所有材料於2017年9月在華中農業大學油菜玻璃溫室進行盆栽種植,花盆直徑25cm,每盆定苗4株,參照正常方法管理溫室,翌年1月至2月份調查花器官數目和角果心皮數目變異。擬南芥突變體clv3-2和野生型Landsbergerecta(ler)購自美國ArabidopsisBiologicalResourceCenter(ABRC)。在晝/夜16h/8h、22℃/18℃、光照強度115～144μmolm-2s-1的培養室內生長。
在白菜型油菜中僅存在1個CLV3的同源拷貝,即位於A4染色體上的BrCLV3(Bra034340)。針對該基因的不同區域共設計了3對PCR引物進行擴增,其中DXP118/DXP120擴增2260bp的啟動子區域,DXP117/DXP121擴增基因編碼區,DXP125/DXP136擴增2541bp的3'下遊區。具體引物序列見表1。擴增產物連入pMD18-T載體上,每個擴增片段挑選4～5個陽性克隆采用載體通用引物測序；使用Sequencher3.1.2軟件比對分析測序結果。
利用SNAPER程序,針對Brclv3Asp12中的C/G單核苷酸變異開發特異性的SNP標記,其中引物對DXP246/249和DXP248/DXP249分別特異性擴增Brclv3Asp12和BrCLV3等位基因。擴增產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。引物序列見表1。SNP標記的PCR擴增體係含50ngµL-1的模板DNA2.0µL、10×PCRbuffer1.0µL、2mmolL-1dNTPs0.8µL、10µmolL-1引物各0.15µL、2UµL-1TaqDNA聚合酶0.15µL,添加ddH2O至10μL。PCR擴增程序為94℃預變性4min；94℃變性30s,59℃退火30s,72℃延伸30s,擴增34個循環；最後72℃延伸10min。
設計分別帶有PacI和AscI酶切接頭的引物對DXP113/DXP114,從srb突變體的cDNA中克隆Brclv3Asp12等位基因,通過酶切連接方法連入pMDC83質粒載體的35S啟動子後麵,獲得35S::Brclv3ASP12超量表達載體。引物序列見表1。載體質粒轉化農杆菌菌株GV3101後通過蘸花法轉化擬南芥clv3-2突變體。收獲的種子播種到含有潮黴素抗性的0.5×MS培養基上篩選轉基因陽性植株。
選取花蕾進行石蠟切片的製作,具體操作程序見Fan等的方法。采用Nikoneclipse80i顯微鏡(日本)觀察切片並照相。
分別合成野生型多肽BrCLV3(RTVPSGPDPLHH)和突變型多肽Brclv3ASP12(RTVPSGPDPLHD),純度＞95%(金斯瑞,中國南京)。用超純水溶解成1mmolL-1母液後過濾消毒,保存於−20℃冰箱中備用。將表麵消毒的擬南芥種子在添加多肽的液體和固體培養基上培養,分別觀察多肽對莖頂端分生組織(shootapicalmeristem,SAM)和主根生長的影響。具體操作程序見Fan等的方法。每種處理至少設置3次生物學重複。
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