殼聚糖是酶法一種海洋來源的相對分子質量小於3000的低聚糖。目前，制备肿瘤殼寡糖大都通過化學法(包括酸解法和氧化法)、壳寡物理法以及酶解法(纖維素酶吲或殼聚糖酶)降解得到。糖及基於殼聚糖酶的其抗專一性與高效性，用其製備殼寡糖的活性方法具有良好的應用優勢和發展潛力。

COS相對分子質量低的酶法特性不但改善了其原料水溶性差的問題.同時其也具有廣泛的生物功能，包括抗炎、制备肿瘤抗菌閉、壳寡抗氧化、糖及降糖同及神經保護等。其抗近年來，活性針對COS抗腫瘤活性的酶法研究逐漸成為熱點。

研究表明，制备肿瘤在多株腫瘤細胞(胃癌細胞、壳寡腎癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞和結腸癌細胞等)中，COS均能達到半數致死的效果。相對分子質量和去乙酰度影響其抗腫瘤活性，且低相對分子質量表現出更為明顯的效果。在作用機製探索方麵，COS可通過誘導HeLa和A549細胞的自噬性死產而抑製細胞增殖，對A549細胞，COS還可明顯降低細胞線粒體膜電位水平而促進細胞凋亡。此外，COS可通過上調p21，下調PCNA、cyclinA和cdk-2基因抑製HepG2細胞的DNA合成速率，抑製細胞增殖；通過誘導SW480細胞阻滯在G2/M期而抑製細胞增殖。由此可見，COS對不同腫瘤細胞的作用和機製並不完全相同，其對腫瘤細胞的作用還有待進一步研究。

為了進一步了解COS潛在的抗腫瘤作用，首先以殼聚糖酶酶解法自行製備COS，建立基於分級處理的COS優化製備工藝，將獲得的低相對分子質量COS產物對不同腫瘤細胞的抗腫瘤活性進行評價初篩，進而在作用最為顯著的人乳腺癌MDA-MB-231細胞中進行量效關係評價及初步機製探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖酶：由作者所在實驗室白行構建的重組菌EcoliRosetta-gami(DE3)/ChiE發酵產酶，經純化濃縮後得到殼聚糖酶酶液，酶活為2260U/mL；COS、氨基葡萄糖、無水乙醇、亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、冰醋酸、Tris：購自國藥集團上海化學試劑公司：鹽酸阿黴素：購於上海麥克林生化科技有限公司：DMEM、RPMI1640基礎培養基、FBS胎牛血清、抗生素、胰酶、Dulbecc0’sPhosphateBufferedSaline(DPBS)：購於美國Gibco公司；納濾膜：購於美國陶氏化學公司；Transwell小室、CellCountingKit-8(CCK-8)試齊0盒：購於美國ThermoFisher公司。
質量分數1％的膠體COS溶液：取1gCOS粉末加入少量去離子水溶脹，加入30mL的0.4mol/L的乙酸溶液攪拌至COS粉末完全溶解，再以2mol/L的NaOH調節pH至6.0，加水定容至100mL。

DNS試劑：準確稱取244.4g酒石酸鉀鈉加到500mL煮沸的蒸餾水中溶解，然後依次加入3，5-二硝基水楊酸6.3g、NaOH21g、苯酚5g和亞硫酸氫鈉5g，攪拌至溶解後定容至1L，棕色瓶中貯存，一周後可使用。

1.2 儀器與設備

pH計：上海Mettler-Toledo公司產品；紫外分光光度計：上海尤尼可儀器有限公司產品：數顯恒溫水浴鍋：金壇區富華電器有限公司產品；高速冷凍離心機：日本日立公司產品；超高效液相色譜串聯四極杆飛行時問質譜聯用儀：美國沃特世公司產品；酶標儀：上海精密科學儀器有限公司產品；細胞培養箱：美國ThermoFisher公司產品；全自動倒置熒光顯微鏡(共聚焦超分辨成像係統)：日本Nikon公司產品。

1.3 方法

1.3.1 COS的酶法製備

探究酶解時間對酶解效果的影響時，反應體係包含製得的質量分數1％COS溶液10mL(乙酸鈉緩衝液，pH6.0)和0.3mL酶液，50℃下酶解8h，間隔1h取樣測定還原糖含量。

探究加酶量對酶解效果的影響時，向質量分數1％的COS溶液中分別加入殼聚糖酶60、90、120、150、180U/g。體係在50℃下酶解4h，反應結束後測定還原糖含量。

1.3.2 DNS法測定還原糖質量濃度

以氨基葡萄糖為標樣，製作標準曲線：準確稱取10mg氨基葡萄糖，溶解定容至100mL，再分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，以去離子水補至1mL，各加入1niLDNS，沸水浴5min，冷卻定容至5mL，於540nm處測定吸光度。空白組為同樣步驟下1mL去離子水。

分別取1mL酶解產物，加入1mLDNS溶液，沸水浴中反應5min，迅速冷卻至室溫，在540nm處測量吸光度。去離子水作為空白對照。

1.3.3 COS的製備工藝

最適酶解條件下得到的殼寡糖酶解液，經100℃水浴15min後10000r/min離心除酶。上清液加入體積分數70％乙醇後4℃過夜。離心收集的上清液依次經截留相對分子質量3000的膜超濾留取濾過液，經截留相對分子質量300的膜納濾收取截留液後，濃縮並凍幹得到COS樣品。

1.3.4 液相色譜-質譜聯用測定COS樣品成分

液相色譜條件：色譜儀WatersaequityUPLC,檢測器WatersaequityPDA，柱溫45℃，流量0.3mL/min，進樣量10μL。質譜條件：電噴霧電離(ESI+)，離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度400℃，掃描範圍m/z20-2000。

1.3.5 細胞培養

HepG2細胞和PATU-8988細胞培養在含體積分數90％RPMll640基礎培養基、體積分數10％胎牛血清、100U/mL青黴素、100μg/L鏈黴素的培養基內；MDA-MB-231細胞基礎培養基為DMEM，其他條件同上。於37℃、體積分數5％CO2的細胞培養箱中貼壁培養，每3d傳一代。

1.3.6 CCK-8法測定細胞生存率

取匯合度90％的細胞，5×10³個/mL的細胞濃度鋪板至96孔板。考察1～1000μg/mL質量濃度範圍內COS對3株腫瘤細胞作用24h的生存率影響。COS與阿黴素(DOX)複合給藥時，首先確定DOX質量濃度為細胞生存率為50％所對應的質量濃度(IC₅₀)，即2.5μg/mL。以質量濃度為1、10、100、1000μg/mL的COS作用6h後給藥DOX孵育24h。之後每孔加10μLCCK-8，孵育1.5h後測A_450nmo陽性對照組為DOX，空白組為培養基，計算細胞生存率，公式如下：

式中：V為細胞生存率，％；A_P為藥物組在450nm處吸光度；A_B為空白組存450nm處吸光度；A_C為對照組在450nm處吸光度。

1.3.7 細胞遷移實驗

匯合度90％的MDA-MB-231細胞消化後，以饑餓培養基重懸，以每孔1×10⁵個接種於24孔板的小室內。細胞完全貼壁後加入500μg/mLCOS培養24h，吸去培養基。多聚甲醛固定30min，DPBS洗3遍，結晶紫染色30min。用流水衝至孔板無色，將小室取出，擦淨內部底麵後倒置拍照。之後將小室放入24孔板中，每孔加1mL體積分數33％冰醋酸，振蕩，取200μL液體測A_570nm。

1.3.8 激光共聚焦檢測細胞對DOX的攝取

將對數生長期的MDA-MB-231細胞以1×10⁴個/mL的細胞濃度鋪板至激光共聚焦專用培養皿。聯用組加入500μg/mLCOS1mL，作用4h後再加入1mL含有2倍終質量濃度DOX培養基，對照組為DOX單獨給藥組。培養箱中繼續孵育1、3、5h。吸去培養基，DPBS洗1遍，經多聚甲醛同定和DAPI染色各20min後，DPBS洗3遍。包裹錫箔紙，避光拍照。

1.3.9 統計學分析

數據采用平均值±標準差表示。單因素數據采用單向方差分析法分析。顯著性差異表示為*4P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。用GraphPadPrism軟件製圖分析。

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