2.2 HPLC法檢測PQQ

本實驗首先研究了其他色譜柱檢測PQQ，吡咯結果發現普通C18柱無法使PQQ有效保留，喹啉醌产更換流動相甲醇和乙腈，生菌或者是选和梯度洗脫都不能保留PQQ。另外發現改變pH可以使PQQ有所保留，菌种鉴定但峰形較差，吡咯且拖尾嚴重，喹啉醌产並且不能很好分離樣品發酵液中的生菌PQQ。考慮到PQQ極性較大，选和因此采用耐100%水的菌种鉴定COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色譜柱來使PQQ有很好的保留。將準備好的吡咯7個不同濃度的PQQ標準品（100，50，喹啉醌产25，生菌12.5，选和6.125，菌种鉴定5，2.5 mg/L）進行HPLC檢測，每個濃度連續進樣3次，每次進樣20 μ L。結果如圖1所示。不同濃度的PQQ均在3.56 min左右出峰。隨著PQQ濃度的增加，峰麵積也逐漸增加。因此PQQ濃度與峰麵積呈正相關的關係。以PQQ濃度為橫坐標，色譜峰麵積為縱坐標，繪製標準曲線，線性關係為y=30.27x+7.32，R2=0.9998，說明線性關係良好。采用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色譜柱檢測PQQ，運行時間短，PQQ出峰時間早，檢測效率高。本實驗建立的HPLC法檢測PQQ具有良好的可行性，可作為菌種產PQQ的複篩方法。

2.3菌株的篩選和鑒定

經光譜法初篩，從100多個樣品中篩選到50多株PQQ產生菌，大多數的產量在2~5 mg/L，少數可以達到10 mg/L左右，HPLC複篩後其中PQQ產量最高的1株為20.6 mg/L，峰圖如圖2所示，PQQ在3.57 min出峰，這是未經優化已報道的搖瓶較高產量。

該菌株的菌落在甲醇培養基平板上為乳白色，粘稠的，邊緣整齊，直徑較小，為1~2 mm。菌體細胞為球狀，革蘭氏陰性，不產芽孢，有莢膜，無鞭毛。該菌株在以甲醇和甲胺為碳源的培養基中能夠良好生長，能利用D-葡萄糖，蔗糖，果糖和木糖。在以銨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白腖和酵母膏為氮源的培養基中能良好生長。采用PCR技術擴增該菌株的16s rDNA 基因序列，經上海生工測序。通過在 NCBI網站中進行同源性序列搜索及比對，從中選取同源性較高菌株的16s rDNA基因序列，以集團外菌種作對照，通過MEGA軟件，用鄰接法（Neighbor-Joining）構建係統發育樹。結果如圖3所示，該菌株與 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的同源性最高，為99%。綜合菌落及菌體形態特征、16s rDNA序列分析，鑒定該菌株為Methylopila sp.菌株，命名為Methylopila sp.Z1。

2.4 甲醇含量的優化

研究甲醇的不同添加濃度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）對OD600和PQQ產量的影響，結果如圖4所示。在0.5%~2.5%的濃度範圍內，隨著甲醇體積濃度的提高，菌體OD600和PQQ產量也逐漸提高，當甲醇濃度為2.5%時，OD600和PQQ產量均達到最高，繼續增加甲醇濃度，OD600和PQQ產量均有明顯下降。這是因為甲醇作為細菌生長的唯一碳源，並且還是細菌細胞甲醇脫氫酶的底物，在其濃度較低時，不足以提供能量使細胞生長，也無法生產過量的PQQ排泄到培養基中，導致PQQ合成效率非常低。當甲醇濃度逐漸提高時，細胞所能利用的碳源增加，菌體OD600和PQQ產量也逐漸增加；當甲醇濃度超過2.5%時，由於甲醇的毒性使細胞損傷，並且底物濃度過高抑製甲醇脫氫酶的活性，導致菌體OD600和PQQ產量下降。因此，2.5%的甲醇體積濃度對於菌體生長和PQQ合成是最佳選擇。

3 結論

目前PQQ的檢測方法主要有重組酶法，氧化還原法，光譜法和HPLC，其中重組酶法所用到的葡萄糖脫氫酶提取繁瑣，純化過程複雜，且得到的酶活不高，不足以支持大量的菌種篩選；氧化還原法中用到的顯色劑氯化硝基四氮唑藍（NBT）易受培養基中其他成分的幹擾，造成陰性結果。光譜法操作簡單，檢測快速，但也可能受到培養基中具有相似波長吸光度的影響，但本實驗采用的是甲醇無機培養基，並通過HPLC檢測樣品發現，基本沒有幹擾，因此光譜法作為PQQ產生菌的初篩是高效可行的。本實驗還建立了新的HPLC法檢測PQQ，采用親水色譜柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ，使得PQQ有很好的保留，並且樣品運行時間短，PQQ在3.56 min出峰，出峰時間早，檢測時間短，峰形無拖尾，為PQQ檢測提供一種新的改進方法。

由於PQQ的生物合成機理沒有得到完全闡釋，通過基因工程和代謝改造提高PQQ的產量遠低於野生菌的產量，因此從環境中篩選具有高產PQQ能力的菌種是十分必要的。本實驗從樣品中篩選到一株PQQ高產菌，經鑒定為Methylopila sp.屬，命名為Methylopila_sp. Z1，未經優化的搖瓶產量達到20.6 mg/L，屬於已報道的較高水平。Z1菌株耐受較高甲醇，在培養基甲醇濃度為2.5%時，PQQ產量達26.7 mg/L，相比於初始濃度提高了28%。Z1是一株有高產PQQ潛力的菌株，後續發酵罐培養和優化工藝將進一步提高PQQ產量。

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