一、夏枯引言
夏枯草(學名為PrunellavulgarisLinn英文名為CommonSelJheal)，草水為唇形科夏枯草屬植物夏枯草的提物幹燥果穗。夏枯草功能繁多，对黑如降血壓、腹果降血脂、蝇寿影响抗菌、夏枯抗病毒、草水降糖、提物抗炎及免疫抑製、对黑治療頭疼眩暈、腹果抑製食管癌ECa109腫瘤細胞的蝇寿影响增殖、調控Raji細胞生長與凋亡、夏枯清除DPPH自由基和較強的草水抗氧化性。另外夏枯草作為一種藥食同源的提物中藥，其開發價值和開發前景非常廣闊，但夏枯草在壽命方麵的研究報道尚少。
草在壽命方麵的研究報道尚少。本研究選用黑腹果蠅作為模式生物對夏枯草水提取物進行抗衰老作用研究。將夏枯草水提取物進行不同程度的稀釋，並分別添加到培養基中飼喂果蠅進行壽命實驗，在壽命實驗的基礎上，發現最高濃度的夏枯草水提物可以延長雌性果蠅壽命，因而對最高濃度進行了深入的研究，以一定時間內雌性果蠅產卵數目來評價夏枯草水提物對果蠅生殖係統的影響，以每分鍾的活動次數來評價夏枯草水提物對果蠅睡眠的影響，以果蠅進食量來評價夏枯草對果蠅熱量攝入的影響。為夏枯草在醫藥、保健品、飲料等相關產品的應用提供參考。
一、材料與方法
1、材料與儀器
夏枯草購買自本草鋪，黑腹果蠅，美國BloomingtonDrosophilaStockCenter(BDSC)購買所得，基因型為Canton-S。
對羥基苯甲酸乙酯、瓊脂粉、無水氯化鈣、葡萄糖，均購買於國藥集團化學試劑有限公司，分析純AR；千島湖純淨水、白砂糖、玉米粉，以上均購買自普通農貿市場；安琪酵母粉，京東；無水乙醇、95％乙醇以及丙酸，購買於杭州米克化工儀器有限公司；亮藍，阿拉丁(上海)。
智能人工氣候箱，寧波萊福科技有限公司；水熱合成反應釜，西安常儀儀器設備有限公司內膽為聚四氟乙烯；電熱恒溫鼓風幹燥機，上海精宏鼓風幹燥箱DHG-9426ASHZ-D(III)型循環水真空泵，邦西儀器科技(上海)有限責任公司；0.229m水係濾膜，生工生物工程(上海)股份有限公司；果蠅活動監測器，美國Trikinetics公司；手動組織研磨器，生工生物工程(上海)股份有限公司l酶標儀，ThermoFisher；離心機，ThermoFisher；透明水浴鍋，金壇實驗儀器。
2、方法
（1）中藥成分的提取
采用水熱合成反應釜高溫提取Illl，取夏枯草1.59加入60mL水，在lOOmL反應釜中，放入電熱恒溫鼓風幹燥機中，反應條件為100℃，反應時間為3h，後冷卻至室溫，用229m水係濾膜真空抽濾機過濾，得到夏枯草水提物40mL(下文使用夏枯草水提物代指此步驟得到的溶液)。
（2）果蠅培養基
高熱量(3.0X)培養基每升含瓊脂15g、酵母300g、白砂糖50g、氯化鈣0.7126g、對羥基苯甲酸乙酯9g溶於30mL的95％乙醇中、丙酸6mL，用來進行壽命實驗。
(3)壽命實驗方法
收集24小時內羽化的果蠅，進行隨機分組並放置到新的果蠅管中，每管約為40隻果蠅，使雌性果蠅與雄性果蠅隨機完成交配。48h後，對交配過的果蠅進行區分雌雄，然後隨機分組，每管中40隻果蠅。壽命實驗分為4個不同濃度：對照組(添加等量的蒸餾水100μL)、低濃度(1∶100稀釋的粗提取液1009L)、中間濃度(1∶10稀釋的粗提取液lOOgL)、高濃度(母液100μL)，每個性別3管。實驗所用溫度為25℃(相對濕度為60％±5％，12h亮12h暗)。實驗每隔一天(0、2、4、6、……)定時為果蠅更換培養基，並統計死亡果蠅的數目，記錄下每天果蠅的死亡數量。延壽率=[(實驗組平均壽命一對照組平均壽命)］／對照組平均壽命×100％。
(4)進食量測定實驗
參考文獻收集方法，收集10天齡的雌雄果蠅各120隻，對照組和實驗組各60隻，每個濃度分成3管，每管20隻果蠅。實驗所用基礎培養基與壽命實驗相同，在食物表麵添加200μL濃度10.8％的亮藍溶液、水1OOμL作為對照組，100μL夏枯草水提物作為實驗組。將果蠅分別放入上述培養基中3h，之後零下18℃冷凍lh，加入1200μL去離子水，用手動組織研磨器研磨碎，高速恒溫離心機9000r／min離心15min，取上清液200μL放入酶標儀中629nm處測量吸光度。
（5）熱刺激
參考文獻方法，收集10天齡的雌果蠅80隻，對照組和實驗組各40隻，每個濃度4管，每管10隻。將果蠅放人幹空的果蠅管中，放入39℃的透明水浴鍋中，每10min記錄一次果蠅的死亡數量(果蠅麵朝上躺在果蠅管底部，且20s內不再抽搐，則記錄為死亡)。
（6）產卵實驗
參考文獻方法，收集10天齡的雌果蠅200隻，對照組和實驗組各100隻，每個濃度5管，每管20隻雌果蠅。實驗所用基礎培養基與壽命實驗相同，在食物表麵添加200μL濃度10．8％的亮藍溶液、水100μL作為對照組，lOOμL夏枯草作為實驗組。將果蠅放在上述處理之後的食物上，並放到與壽命相同條件的培養箱中，22h之後，清除雌果蠅，顯微鏡下計數果蠅卵的個數。
（7）睡眠分析方法
參考文獻方法，收集10天齡的雌雄果蠅各80隻，對照組和實驗組各40隻，每個濃度分成4管，每管10隻果蠅。實驗所用基礎培養基與壽命實驗相同，在食物表麵添加水100I_tL作為對照組，lOOgL夏枯草作為實驗組。放入Trikinetics公司的DAM儀器中進行監測，隔26h之後更換對照與實驗組位置繼續監測，使用pysolo進行數據分析，大於5分鍾活動為0則認為果蠅在睡眠。
3、統計學分析
使用SPSSl7.0軟件對果蠅壽命進行分析和OASIS結合Python的lifelines庫(主要用於計算P—value)。
二、結果與分析
1、夏枯草水提物對果蠅壽命的影響
如表l所示不同濃度的夏枯草水提物對雌雄果蠅的平均壽命、最大壽命的影響，進食最高濃度的夏枯草水提物的雌性果蠅壽命相比較對照組有顯著差異(P＜0.05)，延長平均壽命10.54％、中值壽命10％、最大壽命20％。其他濃度對雌性果蠅均沒有效果，所有濃度對於雄性果蠅均沒有效果。結果表明夏枯草水提物可以延長果蠅的壽命，但是具有性別差異性。
2、夏枯草水提物對果蠅進食量的影響
壽命與熱量的攝人有密切的關係，另外由於壽命實驗已經發現最高濃度的夏枯草水提物可以延長雌性果蠅的壽命，所以需要確定這種延長是否是通過抑製進食量達到的。亮藍是一種藍色染料，果蠅進食之後會使其腸道染色，從而根據亮藍含量的多少來檢測進食量的多少，亮藍的含量可以通過在629nm處的吸光度來檢測，吸光度越大含量越高。
通過圖1分析得到，進食高濃度夏枯草水提物之後會提高果蠅的進食量，其中雌性提高24.42％(P＜0.05)。雄性提高37.4％(P＜0.05)。
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