一、农药免疫分析基礎
免疫分析(immunoassay，残留LA)是酶的免一種以抗原抗體特異性識別與可逆結合反應為基礎的對目標分析物進行定性分析和定量分析的技術。
與常規理化分析相比，活性免疫分析具有選擇性好、抑制疫分靈敏度高、免疫分析容量大、分析簡便快捷、技术成本低、析法安全可靠等優點，农药可大大簡化甚至省去樣品前處理過程，残留可檢測極性強、酶的免難揮發、活性具有同分異構體的抑制疫分農藥，不需要貴重儀器，免疫對使用人員的專業技術要求不高，容易普及和推廣。基於免疫化學技術開發的免疫檢測試劑盒和檢測卡，可應用於大量現場樣品的快速檢測。
20世紀90年代以來，農藥、獸藥等小分子化合物免疫分析技術的研究和開發進展迅速，在糧食、水果、蔬菜、茶葉、蜂蜜、肉、蛋、奶等農副產品和水、土壤等環境樣品中農藥、獸藥殘留物快速監控方麵發揮了重要作用。世界糧食與農業組織(FAO)向許多國家推薦免疫分析技術，美國化學會將免疫分析、色譜分析(包括氣相色譜和高效液相色譜)共同列為農藥殘留分析的主要技術，免疫檢測結果也被列入具有法律效力的證據，成為20世紀後期以來研究開發和應用的熱點之一。
(一)抗原
抗原(antigen，Ag)是一類能誘導免疫係統發生免疫應答，並能與免疫應答產物(抗體或效應細胞)發生特異性結合的物質。抗原性強的物質多數是結構較複雜、分子質量大、具有異物性(抗原與所刺激的機體自身物質的差異性)的物質。病原微生物、組織、細胞、異源蛋白質等多具備上述性質，所以都是良好的抗原。抗原具有免疫原性和反應原性兩種性質。免疫原性是指抗原刺激機體後，誘導免疫係統發生免疫應答，產生相應抗體或效應細胞的特異性免疫反應性。反應原性是指抗原與免疫應答產物抗體發生特異性結合的免疫反應性。
1、抗原的類型抗原根據所起的作用分為完全抗原和半抗原，根據來源和製備方法又可分為天然抗原和人工抗原，根據其與機體的親緣關係可分為同種異體抗原和自身抗原等。
(1)完全抗：原完全抗原(COF~@ete antigen)簡稱抗原，是一類既有免疫原性，又有反應原性的物質。大多數蛋白質、細胞、病毒、細菌等都是完全抗原。
(2)半抗原：半抗原(hapten)是指具有反應原性，但無免疫原性的物質，又稱為不完全抗原。半抗原分為複雜半抗原和簡單半抗原。複雜半抗原(如大多數結構相對複雜的有機化合物等)不具有免疫原性，但具有反應原性。簡單半抗原(如鏈烷等)既不具有免疫原性，又不具有反應原性。
(3)天然抗原：天然抗原是指來自天然生物(如動物、植物、微生物等)的抗原，這類抗原包括細胞、組織、蛋白質、核酸、雜多糖、細菌、病毒等。天然抗原一般都是良好的完全抗原。
(4)人工抗原：人工抗原包括經過人工化學修飾或改造的天然抗原、全合成人工抗原和以大分子為載體的人工抗原。為了研究免疫原性的化學基礎，可用已知化學基團置換複雜天然抗原表麵的特定基團得到人工化學修飾或改造的天然抗原，如2，4-二硝基苯(DNP)修飾蛋白、碘化蛋白等。全合成抗原多為高分子聚合物，如由氨基酸聚合成的多肽等。相對分子質量小於2 500的小分子一般不具備免疫原性，但可將小分子化合物與適當大分子的載體(如蛋白質)共價耦聯製備人工抗原，免疫動物獲得對相應小分子化合物具有特異性識別能力的抗體。
(5)同種異體抗原：同種異體抗原(alloantigen)是指存在於人、同種動物不同個體(同卵孿生者除外)的抗原性物質。當某個體的細胞或組織進入另一個體時，可引起免疫應答。人類血液中的紅細胞血型抗原和白細胞抗原均屬此類。
(6)自身抗原：自身抗原(autoantigen)是指引起自身免疫應答的自身組織成分。一般自身組織對機體沒有免疫原性，但在外傷、感染、電離輻射、藥物等影響下，自身組織可以發生變性成為自身抗原，刺激機體產生免疫反應。自身抗原分為隱蔽的自身抗原和修飾的自身抗原。
2、影響免疫原性的因素
(1)異物性：抗原的化學組成和結構差異越大、生物的種屬和親緣關係越遠，則免疫原性越強。如雞卵清蛋白對家禽是弱免疫原，而對羊、兔等動物則是強免疫原。
(2)分子大小：抗原分子質量越大其免疫原性越強。相對分子質量大於105的蛋白質是較強的免疫原，相對分子質量小於105的物質通常是弱免疫原。Young和Atassi(1986)的實驗結果表明，免疫原性要求的最小多肽分子是由6個以上DNP賴氨酸組成的寡聚肽。在天然多肽中，目前已知能夠引起免疫應答的最小分子是相對分子質量為3 480的升血糖素。
(3)化學組成與結構：除分子質量外，抗原的免疫原性還取決於其化學組成和結構(包括化學基團和構象)。結構越複雜的抗原，其免疫原性越強。比如雜多糖具有免疫原性，而纖維素、糖原、長鏈烷烴等雖然分子質量大，但化學結構比較簡單，則不具備免疫原性。有些抗原對酶、光、熱、氧、化學試劑等因子敏感，化學組成和結構(包括立體結構)易發生變化，其免疫原性也容易發生改變，蛋白質變性後免疫原性會大大降低。
(4)物理狀態：顆粒抗原(如病毒等)比溶解性抗原的免疫原性強，球狀蛋白比線狀蛋白免疫原性強。
3、農藥人工抗原：農藥、藥物等小分子化合物一般不具有免疫原性，但許多農藥、藥物具有反應原性。Landsteiner(1917)在小分子化合物免疫分析方麵進行了開創性研究工作，他將氨基苯磺酸重氮化後與蛋白質的酪氨酸殘基酚羥基鄰位結合，製備人工完全抗原，用該人工抗原免疫動物，獲得了抗氨基苯磺酸抗體，在此基礎上建立了氨基苯磺酸的免疫分析方法。將目標分析農藥以半抗原的形式與分子質量大的蛋白質共價耦聯製備人工抗原，使農藥分子突出於蛋白質表麵作為抗原決定簇，以人工抗原免疫動物，誘導免疫係統發生免疫應答，產生抗目標分析農藥的特異性抗體，在此基礎上建立對該農藥具特異性識別能力的免疫分析方法。
事實上，並非所有農藥半抗原與載體蛋白質共價耦聯後免疫動物，都能產生抗相應農藥的特異性抗體。如對酶、光、熱、氧、化學試劑等因子敏感的農藥，在合成半抗原、製備人工抗原、免疫動物製備抗體的過程中易發生結構變化，難以獲得對這些農藥具特異性親和力的抗體。抗原抗體反應一般在水相中進行，氫鍵和靜電引力是維係抗原抗體親和力的主要作用力之一。結構簡單的鏈狀烷烴，疏水性強，即使其分子質量大，與載體蛋白共價耦聯後免疫動物，也難以獲得抗鏈狀烷烴的抗體。許多具有極性取代基、結構較複雜的農藥(如取代雜環、取代芳香環類農藥，甚至是含三元環的擬除蟲菊酯)半抗原共價結合在蛋白質表麵，成為特定的抗原決定簇，容易激活動物的免疫係統，產生對相應農藥具特異性親和力的抗體。而一些結構簡單、分子質量小的農藥(如甲胺磷)，雖有一些免疫化學研究報道，但至今尚未真正獲得對甲胺磷具特異性親和力、能夠對甲胺磷進行高靈敏度檢測的實用性抗體。
(二)抗體
抗體(antihody)是免疫係統受抗原刺激後產生的能與抗原、半抗原發生特異性結合的球蛋白。免疫球蛋白(immu：nogl()bulin，Ig)通常是一組具有抗體活性和抗體樣結構的蛋白質。免疫球蛋白普遍存在於脊椎動物(包括人)的血液、組織和外分泌液中。所有抗體都是免疫球蛋白，但並非所有免疫球蛋白都是抗體，如骨髓瘤蛋白的結構與抗體相似但無免疫學活性，具有免疫活性的免疫球蛋白才能稱為抗體。
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