將-80℃保存的谷氨杆菌重組菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB以體積分數0.2％接種至含20μg/mL四環素的LB液體培養基中,恒溫搖床37℃、200r/min擴大培養8～10h，酸脱羧酶再以體積分數5％轉接至含20μg/mL四環素的枯草TB發酵培養基中，恒溫搖床37℃、芽孢用200r/min培養2～3h後分別加入一定濃度的表达PLP、PL、谷氨杆菌PN，酸脱羧酶於恒溫搖床33℃、枯草200r/min進行重組蛋白質的芽孢用表達。發酵過程中在不同時間取樣，表达測0D600。谷氨杆菌12000r/min離心1min得到菌體和發酵上清液。酸脱羧酶將菌體用1mL、枯草50mmol/L、芽孢用pH5.0的表达Na2HP04-檸檬酸緩衝液重懸，加入0.6mg/mL溶菌酶，在37℃反應30min後置於冰水中超聲破碎，12000r/min離心5min得到破壁上清液和破壁沉澱，使用SDS-PAGE檢測其蛋白質。
物溶液配製：0.1mol/L-水穀氨酸鈉和0.15mmol/LPLP溶於50mmol/L、pH4.5的Na2HPO4-檸檬酸緩衝液中，置於4℃避光保存。
反應體係：將裝有360uL底物溶液的1.5mLEP管於37℃水浴鍋預熱10min後，加入40uLGAD粗酶液，在37℃下反應4min後，加入600uL、0.2mol/L、pH10的硼酸緩衝液終止反應，置於沸水中滅活10min。
GABA生成量測定：采用HPLC-OPA氨基酸柱前衍生法檢測GABA生成量。
酶活定義：在反應液中，1min催化底物轉化生成1umolGABA所需的酶量為一個活力單位(U)。
本文中重組GAD均指重組菌所產的GAD。
水配製質量濃度為127g/L的一水穀氨酸鈉底物(折算成100g/L穀氨酸，以下均以折算後的穀氨酸質量濃度進行闡述)。在150mL三角錐形瓶中加入20mL底物，加入一定量的濕菌體(在55℃水浴鍋預處理50min，改善細胞膜的通透性)，反應過程中，每隔2h用0.6mol/L的H2SO4和NaOH調節pH，使其始終與初始pH一致。在一定溫度、pH下，150r/min水浴搖床中反應一段時間，終止反應後進行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋並過0.22μm有機濾膜後用HPLC-OPA柱前衍生法進行檢測。
將過濾好的樣品通過HPLC檢測GABA生成量。HPLC色譜條件如下：Agilent1200HPLC色譜儀、Agilent自動進樣器、GLInertsilODS-3液相柱、Agilent紫外檢測器。流動相A：準確量取995mL純淨水，加入4.52g無水乙酸鈉，攪拌使其充分溶解，再加入5mL四氫呋喃和0.2mL三乙胺，之後用冰乙酸調節pH至7.20±0.05，充分混合後用0.22μm無機纖維素濾膜過濾備用：流動相B：準確量取200mL純淨水，加入4.52g無水乙酸鈉，攪拌使其充分溶解，用冰乙酸調節pH至7.20±0.05後，再依次加入400mL色譜純的乙腈和甲醇，用冰乙酸調節pH至7.20+0.05，混合後用0.22μm有機尼龍濾膜過濾備用。梯度洗脫，流量為0.8mL/min，柱溫為40℃。根據吸收峰麵積和GABA標準品峰麵積計算GABA生成量，計算公式如下：
式中：Y為GABA轉化率，％；4為穀氨酸轉化生成GABA的實際質量濃度，g/L；T為穀氨酸轉化生成GABA的理論質量濃度，g/L。
以實驗室保存的質粒pET-24a(+)-gadB為模板，擴增gadB目的片段，並以質粒載體pHY300PLK為模板，擴增表達載體片段。擴增得到的產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的基因片段gadB和質粒表達載體pHY300PLK長度約為1428bp和5731bp，與理論堿基大小一致。驗證正確後通過ExnaseⅡ連接酶將兩個基因片段連接再轉入E.coliJMl09感受態細胞，塗布到LB固體培養基(含氨苄青黴素抗性)後挑取單菌落至LB液體培養基(含氨苄青黴素抗性)中過夜培養。提取質粒，酶切驗證和測序成功後，將重組質粒用電擊轉化法導入表達宿主B.subtilis並塗布到LB固體培養基(含四環素抗性)，之後挑取單菌落至LB液體培養基(含四環素抗性)中培養8～10h，提取質粒後進行酶切驗證分析。結果見圖3，分別在5130bp和2100bp處有明顯的條帶，說明重組表達質粒pHY300PLK-gadB在B.subtilis中構建成功。
種類輔酶及輔酶前體對重組菌產酶情況的影響重組菌按照1.2.4進行搖瓶發酵產酶，搖瓶發酵溫度33℃，在重組菌發酵過程中分別添加輔酶PLP(簡稱GAD-PLP)、輔酶前體PL(簡稱GAD-PL)和PN(簡稱GAD-PN)至終濃度為0.5mmol/L。發酵結束後12000r/min離心1min獲得菌體，用超聲波細胞粉碎機進行細胞破碎，12000r/min離心5min得到GAD粗酶液。結果見圖4，誘導48h後，酶活分別達到25.40、28.14U/mL和15.55U/mL，是對照GAD-0酶活(16.34U/mL)的1.55、1.72和0.95倍。由此可知，添加0.5mmol/LPN時，酶活相較於對照並無明顯區別，這是因為枯草芽孢杆菌中缺少PdxH氧化酶，無法通過PLP補救途徑將PN轉化為PLP，從而提高GAD酶活力。其次隨著誘導培養時間的延長，細胞內合成的少量PLP被自身吸收並消耗而無法滿足GAD表達水平提高的需要。然而向培養基巾添加適量的PLP或PL可以直接或問接通過PLP補救途徑合成PLP，從而提供能夠維持GAD穩定的輔酶PLP，促進GAD的折疊，提高酶活。鑒於PLP成本高於PL，所以在發酵過程中選擇添加PL進行後續實驗。
重組菌按照1.2.4進行搖瓶發酵，在過程中添加不同濃度的PL(0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.2、0.3mmol/L)發酵培養48h後，12000r/min離心1min獲得菌體，超聲波細胞破碎機進行細胞破碎，12000r/min離心5min得到GAD粗酶液，結果見圖5。隨著PL濃度的增加，GAD酶活也隨之提高，當PL濃度為0.1mmol/L時，GAD酶活達到最高為28.28U/mL。繼續增加PL的濃度，酶活並未發生顯著變化，故可知PL的最適添加濃度為0.1mmol/L。圖6為發酵過程中添加不同濃度PL後的重組GAD蛋白質電泳圖，從圖中可見在相對分子質量53000的條帶附近有一條清晰的蛋白質電泳條帶，符合GAD理論蛋白質相對分子質量大小。
重組菌按照1.2.4進行搖瓶發酵，在過程中添加0.1mmol/LPL，探究其在不同發酵時間(0、12、24、36、48、60h)對重組菌生長(見圖7)和產GAD情況(見圖8)的影響。與GAD-0相比，在發酵時問36h左右，PL對菌體的生長有一定的促進作州，是因為存蛋白質表達過程中，通過PLP補救途徑，PdxK激酶將PL磷酸化形成PLP，促進GAD的折疊，一定程度上有利於菌體生長。隨著發酵時問的延長，南於PLP穩定性差而失去作用,導致菌體的生長有所下降。由圖8可知，與GAD-0相比，GAD-PL酶活最高達到28.28U/mL，添加適量的PL可以提供給GAD未知濃度的PLP，從而提高GAD酶活。
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