3、固相高效色譜分析條件

Agilent5HC-C18（2）（4.6×250mm，液相5μm）色譜柱，色谱时测進樣量20μL，法同流速1.0mL/min，定糕点中的研柱溫35℃，种添以甲醇作為流動相A，加剂究以0.02moI/L乙酸銨溶液為流動相B，固相高效梯度洗脫，液相洗脫條件見表1。色谱时测使用二極管陣列檢測器，法同光譜範圍190～700nm；光譜步進值為2.0nm，定糕点中的研光譜采集模式。种添以保留時間及光譜圖定性，加剂究在230nm和625nm波長下進行檢測，固相高效峰麵積外標法定量。

二、結果與討論

1、色譜條件的優化

本試驗比較乙腈-0.02mol/L乙酸銨和甲醇-0.02mol/L乙酸銨按表1梯度進行洗脫時，發現新紅與苯甲酸，靛藍與脫氫乙酸分離度達不到1.5的要求，原因可能有幾點：首先，乙腈洗脫能力比甲醇強，在UV波長較短的色譜分析上具有較高靈敏度，且色譜級的乙腈是吸收能力比較小的有機溶劑，故乙腈過強的洗脫能力以及乙腈特有的性質都會造成出峰時間靠前的目標物和雜質峰或者相鄰的峰分不開；其次，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、納他黴素極性相較胭脂紅、日落黃、誘惑紅極性偏強，采用乙腈階梯式梯度洗脫，出峰速度快，無法控製基質基線幹擾；再者，糕點中的基質大多數為無機鹽、蛋白質、糖類等，乙腈洗脫不能有效避免這些基質對目標物的幹擾，試驗中也通過調整梯度洗脫的比例，但是無論如何調整仍然無法將13種目標物完全分離，然而采用甲醇洗脫能夠有效避免乙腈存在的這些問題，結果見圖1。本次試驗還選擇了甲醇一0.02mol/L乙酸銨與甲醇-0.02mol/L磷酸二氫銨溶液進行梯度洗脫，13種食品添加劑均為極性物質，與水均能互溶，采用0.02mol/L磷酸二氫銨對防腐劑的分離沒有影響，但是這個水係的流動相對色譜分離影響較大，大部分色譜均不能有效洗脫，結果見圖2，綜合考慮，本試驗最終選擇甲醇一0.02mol/L乙酸銨按表1程序進行分離。

2、樣品前處理優化

（1）蛋白沉澱劑的選擇

人工合成色素與防腐劑、甜味劑的前處理方法不同，參考相關文獻，本次試驗針對糕點中的基質，選擇水係蛋白沉澱劑，即106g/L亞鐵氰化鉀和219g/L乙酸鋅溶液進行處理，這兩種水係蛋白沉澱劑均為中性鹽，中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉澱蛋白質是一種鹽析反應，由於蛋白質是一種膠體，乙酸鋅與亞鐵氰化鉀反應生成的氰亞鐵酸鋅沉澱能夠挾走或吸附幹擾物質，且這兩種中性鹽除蛋白能力強，同時高濃度的鹽離子水化能力很強，能夠將蛋白質分子的水化層奪取，鑒於各種蛋白質分子顆粒大小不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同，本次試驗經過反複測試，最終采用106g/L亞鐵氰化鉀溶液和219g/L乙酸鋅處理樣品中蛋白質效果最佳。

（2）固相萃取柱的選擇

本次試驗通過樣品加標回收進行考察，分別稱取陰性樣品6份，每份2.59，各精密加入標準混合儲備液1.0mL，其餘稱取粉碎均勻的糕點樣品2.5g置50mL離心管中，加25mL水，各加5mL106g/L亞鐵氰化鉀溶液和5mL219g/L乙酸鋅溶液，渦旋10min後，加水定容至50mL，經10000r/min冷凍離心10min後取出，量取上清液5mL過QasisWAX固相萃取小柱（預先經3mL甲醇以及3mL水活化），棄去流出液，依次用6mL2％甲酸和6mL純化水清洗，再用5％氨化甲醇洗脫並收集於15mL離心管中，在40℃水浴中氮吹至近幹後取出放置室溫，用5mL水複溶殘渣，過0.45μmGHP微孔濾膜後，待測。

結果見表2，從結果可以看出，WatersOasisWAX固相萃取小柱回收率最高，對本次試驗的13種食品添加劑富集比較好，WatersOasisHLB固相萃取小柱和WatersOasisMCX固相萃取小柱回收率次之，原因可能是，WatersOasisWAX固相萃取小柱特點為混合型弱陰離子交換反相吸附劑，具有弱陰離子交換和非極性疏水雙重作用的混合吸附劑，對強酸性化合物具有高的選擇性和靈敏度，含弱堿性的胺基功能基團，適用於從堿性或中性物質中分離純化酸性物質，可用於強酸性化合物的處理，本次試驗的13種添加劑均為水溶性化合物，采用WAX進行富集，2％甲酸清洗能夠將樣品中離子狀態的雜質清洗去除，再用5％氨化甲醇將富集在固相萃取小柱分子狀態的添加劑進行離子化洗脫下來；WatersOasisHLB內的吸附劑是通過一個“特殊的極性捕獲基團”來增加對極性物質的保留提供很好的水浸潤性，用於酸性，中性和堿性化合物的通用型吸附劑，這種性質用於分析人工合成色素極好的，但是這個小柱對防腐劑中的納他黴素和富馬酸二甲酯的保留富集效果較差，原因可能是HLB內填料是親脂性化合物，而納他黴素和富馬酸-ep酯是親水性的，WatersOasisMCX固相萃取小柱是混合型陽離子交換反相吸附劑，對堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度，MCX小柱對部分色素和防腐劑的富集效果也比較差，不能同時對13種成分進行分析，故本次試驗選擇WatersOasisWAX固相萃取小柱進行。

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